活性綠 19修飾花生殼粉微球的制備及對(duì)溶菌酶的吸附

楊麗超,孫小梅,李步海

中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430074

活性綠 19修飾花生殼粉微球的制備及對(duì)溶菌酶的吸附

楊麗超,孫小梅,李步海＊

中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430074

以天然產(chǎn)物花生殼粉作為基質(zhì),環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑,活性綠 19(Reactive Green 19,簡(jiǎn)稱 RG19)為修飾劑,制備了新型的生物吸附劑 RG19修飾花生殼粉微球,比較了 RG19修飾花生殼粉前后對(duì)溶菌酶的吸附性能,包括吸附溶液的 pH,溶菌酶的初始濃度,吸附時(shí)間,溫度及 NaCl的濃度對(duì)吸附的影響。結(jié)果表明,用 25.0 mg RG19修飾花生殼粉微球處理溶菌酶溶液 10 mL,pH值 7.4,吸附時(shí)間 4 h的條件下,對(duì)溶菌酶的吸附量是 149.6 mg·g-1,其酶活力保持率為 96.4%,而未修飾的花生殼粉微球?qū)θ芫傅奈搅恐挥?23.6 mg·g-1,修飾后是修飾前的 6.3倍。在上述條件下從雞蛋清中分離純化溶菌酶,純化倍數(shù)為 31.0,收得率為 64.2%。而且該吸附劑的復(fù)用性好。

花生殼粉;活性綠 19;修飾;吸附;溶菌酶

Abstract:A new bio-adsorbent from natural product peanut shellwas prepared with epichlorohydrin and Reactive Green 19(RG19)as crossliking and modification agents,respectively.The adsorption behavior of the modified product for lysozyme in the different conditions,including pH,initial concentration of lysozyme,contact time,temperature,and NaCl concentration,was investigated by comparison with unmodified one.The lysozyme adsorption capacity of RG19 modified peanut shellwas 149.6 mg·g-1,when 10 mL lysozyme solutionwas absorbedwith 25.0 mgmodified peanut shell atpH 7.4,and stirring for 4 h.However,the adsorption capacityof unmodified peanut shell justwas23.6 mg·g-1,and the former is 6.3 times of the latter.The seperation and purification of lysozyme from egg white were achieved.The lysozyme was purified 31.0-fold in a single step with a recovery 64.2%.In addition,the repeat usefulness of this new-style absorbent is better.

Key words:peanut shell;Reactive Green 19;modification;adsorption;lysozyme

我國(guó)花生產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的 1/3,其加工過(guò)程中產(chǎn)生的花生殼每年約有 450萬(wàn)噸,大部分當(dāng)作燃料或廢渣棄去,造成資源的極大浪費(fèi),直接影響了花生的綜合利用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；ㄉ鷼さ闹饕煞质悄舅?纖維素和半纖維素,即含有大量的羥基,能與許多配基 (如三嗪環(huán))發(fā)生反應(yīng)。近年來(lái),花生殼的開(kāi)發(fā)利用已引起人們的重視,將其用于廢水處理方面的研究已有報(bào)道[1-3]。

堿性蛋白溶菌酶 (1ysozyme)常被作為研究蛋白質(zhì)的模型體,是一種能特異水解微生物細(xì)胞壁多糖類物質(zhì)的酶,它能損壞細(xì)菌細(xì)胞壁使細(xì)菌死亡,而對(duì)無(wú)細(xì)胞壁的人體細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生不良影響,所以在臨床上溶菌酶廣泛用于某些炎癥的治療和清除壞死的組織等,除此在食品工業(yè)、醫(yī)療、生物學(xué)領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。因此開(kāi)發(fā)用天然產(chǎn)物作基質(zhì)的吸附劑,分離純化家禽蛋清中的動(dòng)物溶菌酶具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。溶菌酶廣泛存在于自然界動(dòng)物、植物及微生物中,但以卵清中含量為最高 (約 3%),而且蛋清來(lái)源廣泛,因此多數(shù)商品溶菌酶是從蛋清中提取的,有關(guān)蛋清中提取溶菌酶的報(bào)道有很多[4-6]。

有用三嗪類染料修飾殼聚糖微球[7]和聚合物薄膜[8]分離純化蛋白質(zhì)的報(bào)道。本文選用新的基質(zhì)——花生殼粉,用配基染料 RG19進(jìn)行修飾制備了一種新的生物吸附劑,考察了此吸附劑對(duì)溶菌酶的吸附性能,并從雞蛋清中提取了動(dòng)物溶菌酶。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LAMBDA B10 35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (美國(guó)珀金-埃爾默公司);拉曼光譜儀 (renishaw inVia Raman Microscope,UK);SHZ-03恒溫水浴搖床 (上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司);TGL-16G臺(tái)式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司);手提式中藥粉碎機(jī) (青州天地中藥設(shè)備廠);pHS-3C型精密酸度計(jì) (上海虹益儀表有限公司)。

Reactive Green 19(美國(guó) Sigma);溶菌酶 (Sigma公司);溶壁微球菌干粉 (Sigma公司);花生殼 (購(gòu)于武漢市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),花生殼用粉碎機(jī)打碎過(guò)篩,選取100-120目的顆粒)。

1.2 RG19修飾花生殼粉的制備與表征

1.2.1 制備方法

稱取花生殼粉 10.0 g置于 250 mL的燒瓶中,分別加入 1.25 mol·L-1的 NaOH溶液 80 mL和環(huán)氧氯丙烷 30 mL,于 40℃下攪拌反應(yīng) 1 h,過(guò)濾,用蒸餾水洗至濾液呈中性,70℃下干燥至恒重,得到交聯(lián)花生殼粉[9]。

稱取交聯(lián)花生殼粉 1.0 g置于 20 mL 0.5 mol·L-1的 NaCl溶液中溶脹 1 h。將 0.5 g RG19溶解在15 mL水中,在電動(dòng)攪拌下轉(zhuǎn)入上述 NaCl溶液中。加 Na2CO3調(diào)節(jié) pH至 10.0,于 80℃下攪拌反應(yīng) 4 h,抽濾,水洗至濾液無(wú)色,再用無(wú)水乙醇洗幾次,60℃烘干至恒重 (約 1.1 g),置于干燥器備用。

1.2.2 制備條件的正交設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)三因素三水平 L9(33)的正交實(shí)驗(yàn)確定制備反應(yīng)中各因素的影響。三因素三水平為:A:NaCl溶液 :0.5 mol·L-1,1.0 mol·L-1,2.0 mol·L-1;B:RG19用量:30,50,150 mg;C:反應(yīng)時(shí)間:2,4,6 h。

1.2.3 紅外和拉曼光譜

用 KBr壓片,FTIR檢測(cè) 400～4000 cm-1處各峰的變化,研究交聯(lián)前后花生殼粉表面官能團(tuán)的變化。

用拉曼光譜儀測(cè)定和比較修飾 RG19前后的花生殼粉微球,選擇氬離子激光器,激光波長(zhǎng) 514 nm,透過(guò)率 50%檢測(cè)。

1.3 吸附實(shí)驗(yàn)

分別稱 25.0 mg RG19修飾或未修飾的花生殼粉微球置于 50 mL錐形瓶中,加 10 mL 0.2 mg·mL-1的溶菌酶溶液,放入搖床 (轉(zhuǎn)速 120 r·min-1)吸附 4 h后離心,用分光光度法測(cè)定上清液在 280 nm處的吸光度,并用對(duì)照法計(jì)算溶菌酶的吸附率。

吸附率 =(吸附前溶菌酶的量-吸附后上清液中溶菌酶的量)/吸附前溶菌酶的量 ×100%

1.4 洗脫實(shí)驗(yàn)

吸附完畢,離心,棄上清液,加 10 mL洗脫劑溶液,將錐形瓶放入搖床 (轉(zhuǎn)速 120 r·min-1)振蕩洗脫,4 h后離心,用分光光度法測(cè)定上清液在 280 nm處的吸光度,計(jì)算洗脫率。

1.5 溶菌酶活力的測(cè)定

按文獻(xiàn)[10]提供的方法。

1.6 從雞蛋清中提取溶菌酶

取蛋清,用 0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液稀釋一倍,離心 (120000 r·min-1)15 min吸取上清液放入冰箱備用。

取 10 mL上述處理的蛋清放入 50 mL錐形瓶中,在選定的吸附條件下吸附飽和后,用 0.7 mol·L-1的NaCNS溶液解析。并分別測(cè)定蛋清液純化前后在 280 nm處的吸光度,依 Brodford法[11]計(jì)算蛋清中的蛋白含量,代入酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶菌酶含量。按 1.5節(jié)方法測(cè)定蛋清純化前后的酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 微球制備的正交結(jié)果與評(píng)價(jià)

極差 R計(jì)算分析,R值越大的因素重要性越強(qiáng),表 1可知:RG19用量的 R最大 (R=18.5)說(shuō)明是關(guān)鍵因素,時(shí)間為一般因素,NaCl為次要因素。根據(jù) T值的大小,NaCl的三個(gè)水平的 T值差異小,因此 NaCl濃度選 0.5 mol·L-1;反應(yīng)時(shí)間 4 h時(shí),T值最大;結(jié)果分析 RG19用量影響為主,因此,再用單因素實(shí)驗(yàn)確定 RG19用量是 500 mg。

表1 RG19修飾花生殼粉微球的正交表Table 1 Orthogonal experimental design of modified peanut shellwith RG19

0.5 6 1 5 0 6 4.1④1.0 4 3 0 4 4.9⑤1.0 6 5 0 4 0.1⑥1.0 2 1 5 0 5 3.8⑦2.0 6 3 0 5 2.8⑧2.0 2 5 0 3 8.9⑨2.0 4 1 5 0 7 4.2 T1 5 7.5 4 7.9 4 9.5 T2 4 6.3 5 8.8 4 5.5 T3 5 5.3 5 2.3 6 4.0 R平均值 2.2 1 0.9 1 8.5③

2.2 紅外和拉曼光譜分析

圖1為交聯(lián)前后花生殼粉的紅外光譜。3360 cm-1為 O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰,交聯(lián)后明顯減弱,表明-OH參與交聯(lián)反應(yīng);1740 cm-1為 C=O吸收峰,交聯(lián)后消失,說(shuō)明 C=O參加了反應(yīng);1380 cm-1為纖維素和半纖維素中 C-H的變形振動(dòng)吸收峰,1270 cm-1為愈創(chuàng)木基芳香環(huán)上甲氧基和木質(zhì)素中 C-O的振動(dòng)吸收峰,1060 cm-1為纖維素和半纖維素中 C-O伸縮振動(dòng)吸收峰,交聯(lián)后這三個(gè)峰明顯減弱,說(shuō)明在交聯(lián)過(guò)程中被脫除的混合物中含有芳香環(huán)和 C-O鍵。

圖2為修飾 RG19前后的花生殼粉微球的拉曼譜圖。兩者相比,修飾后出現(xiàn)的幾處明顯峰波:1580 cm-1為芳香類 C-C的伸縮振動(dòng);1409 cm-1為 N=N(芳香取代)的伸縮振動(dòng);1355 cm-1和 1166 cm-1分別為(-C)SO3的對(duì)稱伸縮振動(dòng)和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)。與RG19的結(jié)構(gòu)含 6個(gè)苯環(huán),兩個(gè)芳香取代的-N=N-基團(tuán),6個(gè) (-C)SO3H基團(tuán)相符。由此可見(jiàn),RG19已修飾到花生殼粉微球上。

2.3 RG19修飾花生殼粉微球吸附溶菌酶的條件

2.3.1 溶液 pH

圖4可見(jiàn),pH從 5.0到 7.4,吸附率逐漸增加;7.4到 8.5時(shí),溶菌酶完全吸附。這是基于兩個(gè)因素影響溶菌酶的吸附:一、溶菌酶的等電點(diǎn)為 11.2,當(dāng) pH小于 11.2時(shí),溶菌酶帶正電荷;二、活性綠 19為陰離子染料,結(jié)構(gòu) (如圖 3)包括六個(gè)磺酸基,一個(gè)伯氨基,四個(gè)仲氨基和幾個(gè)疏水苯環(huán)。pH從 5.0到7.4,溶菌酶所帶正電荷逐漸減少,而磺酸基的質(zhì)子化逐漸減弱 (即與正電荷結(jié)合的能力逐漸增加),而此時(shí)后者對(duì)吸附的影響較大,所以隨 pH增加對(duì)溶菌酶的吸附能力增加,吸附率提高。由此可知,pH在 7.4～8.5的范圍內(nèi) RG19修飾的花生殼粉微球?qū)θ芫傅奈叫Ч驾^好。而未修飾 RG19的花生殼粉微球在相同酸度下對(duì)溶菌酶的吸附量都很小。

圖3 活性綠 19的結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical struction of Reactive Green 19

2.3.2 吸附時(shí)間

選擇不同的吸附時(shí)間,考察了修飾 RG19前后花生殼粉微球的吸附性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),修飾后的微球開(kāi)始時(shí)吸附速率較大,3 h時(shí)達(dá)到吸附飽和。這是因?yàn)槲介_(kāi)始時(shí),溶液中的溶菌酶濃度較高,而微球上的吸附位點(diǎn)很多,因此吸附速率較高,隨著吸附的進(jìn)行,溶液中溶菌酶濃度減小,微球上的位點(diǎn)也逐漸占滿,導(dǎo)致吸附速率下降。而修飾前的微球由于對(duì)溶菌酶的吸附量很小,很短時(shí)間內(nèi)就達(dá)到吸附飽和。

2.3.3 溶菌酶的濃度

圖5顯示,溶菌酶濃度增大,吸附量也增大。當(dāng)溶菌酶的濃度為 1.0 mg·mL-1時(shí),達(dá)到最大吸附量149.6 mg·g-1,再加大溶菌酶濃度,吸附量不會(huì)增加。而未修飾 RG19的微球?qū)θ芫傅奈搅恐挥?3.6 mg·g-1。這是因?yàn)槿玖?RG19與蛋白分子間存在特異性和非特異性作用,其中特異性親和吸附是主要的,所以對(duì)溶菌酶的吸附量大;而未修飾RG19的微球?qū)θ芫钢皇欠翘禺愋晕?吸附量很小。證實(shí)修飾后的吸附劑性能優(yōu)于修飾前。

2.3.4 吸附溫度

當(dāng)溫度低于 15℃時(shí)吸附效果會(huì)明顯下降。在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi) (20～45℃)吸附劑對(duì)溶菌酶的吸附率不受溫度的影響。

2.3.5 離子強(qiáng)度

離子強(qiáng)度對(duì)吸附行為有重要的影響。由圖 6可見(jiàn),隨著離子強(qiáng)度的增加,溶菌酶的吸附率明顯減小。當(dāng) NaC1的濃度從 0.0 mol·L-1增加到 0.5 mol·L-1時(shí),修飾 RG19的微球?qū)θ芫傅奈铰视?00%降至 2.13%。因?yàn)殡x子強(qiáng)度的增加使蛋白質(zhì)分子處于更多的離子氛圍中,與配體結(jié)合的空間阻礙和靜電排斥作用增大;而且鹽離子也會(huì)與配體分子的基團(tuán)作用,阻礙配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合。當(dāng) NaC1的濃度為 0.2 mol·L-1時(shí),未修飾 RG19的微球?qū)θ芫笩o(wú)吸附。

2.4 溶菌酶的洗脫及吸附劑的復(fù)用性

研究了兩種洗脫劑 NaCNS和 NaCl在不同濃度下的洗脫效果。圖 7表示,兩種洗脫劑都隨鹽濃度的增加,洗脫率加大;當(dāng)鹽濃度再升高時(shí),洗脫率略下降。不同的是洗脫劑不同對(duì)溶菌酶的脫附效果不同,當(dāng) NaCNS濃度為 0.7 mol·L-1洗脫率達(dá) 97.4%;而 NaCl濃度為 1.0 mol·L-1時(shí),洗脫率僅 71.6%。說(shuō)明NaSCN比NaC1對(duì)溶菌酶的解吸作用更好。這種現(xiàn)象解釋如下:一方面隨著洗脫劑中鹽濃度的增加,體系中離子強(qiáng)度也隨之增加,使蛋白分子和染料配體間的靜電相互作用減弱,而且,離子強(qiáng)度的增加,也會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象,使蛋白質(zhì)的疏水作用減弱,從而促進(jìn)了蛋白的脫附。此外,SCN-離子極易與蛋白分子結(jié)合,也促進(jìn)了蛋白質(zhì)的洗脫。此外,經(jīng)三個(gè)吸附一洗脫周期后,吸附劑的吸附量?jī)H減少了 1%,證明吸附劑的復(fù)用性能較好。

2.5 吸附過(guò)程溶菌酶活力的變化

為了考察吸附過(guò)程對(duì)溶菌酶活力的影響,對(duì)吸附前后的溶菌酶進(jìn)行了活力測(cè)定,平行實(shí)驗(yàn) 3次。吸附前酶的比活力為 18667 U·mg-1,吸附后洗脫下的酶比活力為 17994 U·mg-1。酶的比活力保持率為96.4%。

2.6 從雞蛋清中分離純化溶菌酶

為了考察該吸附劑提取溶菌酶的實(shí)用性,平行三次從雞蛋清中提取分離溶菌酶,結(jié)果見(jiàn)表 2:提純前雞蛋清的比活力是 126 U·mg-1,提取的粗溶菌酶的比活力是 3900 U·mg-1,純化倍數(shù)為 31.0,收得率為 64.2%。

表2 雞蛋清中溶菌酶的分離純化結(jié)果Table 2 Purification of lysozyme from eggwhile

3 結(jié)論

用 RG19修飾環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的花生殼粉微球,制備的生物吸附劑可親和吸附溶菌酶。因三嗪染料配基與蛋白質(zhì)的特異性作用,使該生物吸附劑具有吸附平衡快,吸附容量大,酶活力保持率高,吸附劑復(fù)用性好的特點(diǎn)。從雞蛋清中純化溶菌酶,純化效果明顯。

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Preparation of Reactive Green 19 Modified Peanut Shell and Adsorption Behavior for Lysozyme

YANGLi-chao,SUN Xiao-mei,L IBu-hai＊
Key Laboratory of Analytical Chem istry of the State Ethnic Affairs Comission,South-central University forNationalities,W uhan 430074,China

O652.6;X712

A

1001-6880(2011)01-0030-05

2010-05-17 接受日期:2010-09-10

國(guó)家民委院?；?MJY00004)

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