吳伯岳，嚴(yán)秀平

南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析科學(xué)研究中心，天津 300071

稀土發(fā)光材料在熒光成像中的應(yīng)用

吳伯岳，嚴(yán)秀平

南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析科學(xué)研究中心，天津 300071

稀土發(fā)光材料由于具有熒光壽命長、發(fā)射峰半峰寬窄和Stokes位移大等發(fā)光性質(zhì)，在生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，包括熒光免疫分析、離子識別、蛋白質(zhì)活性測定、核酸檢測等，有著廣泛而重要的應(yīng)用前景。本文以稀土配合物、稀土摻雜上轉(zhuǎn)換材料和長余輝材料為代表，就當(dāng)前稀土發(fā)光材料的發(fā)光性質(zhì)及其在生物成像標(biāo)記方面的研究做一綜述，并對稀土發(fā)光材料，特別是長余輝材料，在熒光成像應(yīng)用過程中存在的主要問題進(jìn)行了討論。

稀土發(fā)光材料；熒光成像；稀土配合物；上轉(zhuǎn)換材料；長余輝材料

引 言

隨著醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展，光學(xué)成像技術(shù)作為一種簡單、快速、靈敏且低成本的手段，在疾病早期診斷和治療等方面發(fā)揮著越來越重要的作用[1]。如何開發(fā)更加高效、多功能的熒光成像探針，同步觀察細(xì)胞內(nèi)多種生物活性物質(zhì)的細(xì)胞定位、相互作用及其動態(tài)變化，以獲得“細(xì)胞內(nèi)的生命快照”，受到越來越多的關(guān)注[2]。

由于大多數(shù)生物活性分子沒有天然熒光或熒光量子產(chǎn)率很低，因此對生物體內(nèi)重要目標(biāo)分子的實時動態(tài)監(jiān)測必須借助外來的標(biāo)記物，以便獲得可測量的信號用來分析。理想的標(biāo)記物應(yīng)具有以下性質(zhì)：1)光穩(wěn)定性良好，不易被光解或漂白；2)對生物體本身功能沒有影響或影響很??；3)發(fā)射光譜特性突出，特別是對多種組分標(biāo)記后，在同一光源照射下(同一波長光激發(fā)下)可發(fā)射不同顏色的光，以便于對各種組分的區(qū)分；4)激發(fā)光范圍可變，避免使用高能紫外光對生物組織的傷害[3]。目前，在生物成像研究中應(yīng)用最普遍的熒光探針是有機(jī)熒光染料 (如異硫氰酸熒光素FITC及花菁染料cy3和cy5等)。有機(jī)熒光染料不僅光化學(xué)穩(wěn)定性差，而且容易發(fā)生光漂白與光解，不利于較長時間的觀察。此外，由于它們的激發(fā)光譜較窄且發(fā)射光譜較寬，不同的有機(jī)熒光分子常需要不同波長的光來激發(fā)。因此，如何對細(xì)胞內(nèi)，特別是活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行實時、原位的動態(tài)監(jiān)測，進(jìn)而為蛋白質(zhì)的研究提供活體全景式的技術(shù)平臺，目前已成為國際上的研究熱點和尚未解決的技術(shù)難點。

近年來，隨著納米技術(shù)、生物技術(shù)與材料制備技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是對以物理學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)等為基礎(chǔ)發(fā)展起來的具有優(yōu)異光學(xué)性質(zhì)及水溶性和生物相容性的量子點制備技術(shù)的深入研究，量子點已廣泛應(yīng)用于各種生物分子的熒光檢測，特別是為多種分子的同時實時動態(tài)檢測提供了可能。目前的研究證實，半導(dǎo)體量子點的發(fā)光特性具有以下特點[4,5]：1)量子點的激發(fā)波長范圍寬且連續(xù)分布，而發(fā)射波長的范圍窄且分布對稱，斯托克斯 (Stokes)位移大，不同半導(dǎo)體材料的量子點或同一材料不同粒徑的量子點在同一光源照射下發(fā)射不同顏色的光，即發(fā)射光譜很少交疊;2)量子點熒光量子產(chǎn)率高，發(fā)光強(qiáng)度大，光化學(xué)穩(wěn)定性好，不易被光解或漂白。量子點的這些光學(xué)特征十分適合于作為熒光成像探針。但是，現(xiàn)有量子點在擁有上述優(yōu)點的同時也存在一定的問題：1)生物自身熒光干擾。作為生物標(biāo)記物，大部分量子點的發(fā)光在可見光范圍內(nèi)，容易受到生物組織背景熒光的干擾，影響成像或檢測的效果。2)量子點潛在的化學(xué)毒性。由于已知的量子點多數(shù)含有重金屬離子，如Cd2+、Hg2+、Pb2+等，這些離子會在生物環(huán)境中緩慢地從量子點表面剝離，而現(xiàn)有的在量子點表面包覆無毒ZnS殼層的方法并不能長時間 (～24 h)地保護(hù)生物組織和避免細(xì)胞死亡[6,7]。這些性質(zhì)都限制了量子點作為熒光探針在生物成像和熒光檢測方面的應(yīng)用。

稀土發(fā)光材料由于具有熒光壽命長、發(fā)射峰半峰寬窄和Stokes位移大等發(fā)光性質(zhì)，引起了人們的重視與關(guān)注[8,9]。目前，由于稀土化合物優(yōu)越的光學(xué)特性，該類熒光探針在生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域都已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，包括熒光免疫分析[10～13]、陰陽離子識別[14～19]、蛋白質(zhì)活性測定[20～24]、核酸檢測[25～30]等。近年來，隨著各種類型的水溶性稀土化合物的不斷合成，稀土化合物熒光探針得到了更廣泛的應(yīng)用，尤其在熒光成像方面，越來越顯示出它的優(yōu)越性[31]。

稀土配合物在熒光成像領(lǐng)域的應(yīng)用

稀土配合物的發(fā)光機(jī)理

稀土離子的發(fā)光是通過自旋禁阻的f-f躍遷而產(chǎn)生 (摩爾吸光系數(shù)＜10 l/mol·cm)的，而且與稀土離子配位的水分子的高頻O-H振動能夠淬滅其發(fā)光。因此在溶液中，稀土離子Sm3+、Eu3+、Tb3+、Dy3+等在高能量激發(fā)下本身雖然會發(fā)射熒光，但是非常微弱。然而，當(dāng)它們與一些有機(jī)配位體 (如β-二酮類、芳香羧酸衍生物類)形成配合物時，其熒光強(qiáng)度就會明顯地增強(qiáng)。

稀土配合物的發(fā)光是配體向稀土離子能量轉(zhuǎn)移的結(jié)果，其發(fā)光是由稀土離子本身所決定的[32]。稀土配合物的熒光產(chǎn)生過程如下：當(dāng)稀土配合物受到光激發(fā)時，有機(jī)配體分子首先吸收能量，從單重態(tài)的基態(tài)S0躍遷至激發(fā)態(tài)S1，隨后激發(fā)態(tài)可以通過輻射方式回到基態(tài)S0，也可以通過非輻射方式傳遞給三重態(tài)的激發(fā)態(tài)T1或T2；三重態(tài)的激發(fā)能以非輻射方式將能量傳遞給稀土離子，或者通過輻射方式失去能量回到基態(tài)，從而發(fā)出磷光；處于激發(fā)態(tài)的稀土離子的能量躍遷也有兩種方式，以非輻射方式或者輻射方式躍遷到較低的能態(tài)再到基態(tài)，當(dāng)以輻射方式從高能態(tài)躍遷到較低能態(tài)時就產(chǎn)生了熒光[32]。圖1為稀土配合物發(fā)光機(jī)理示意圖。稀土離子熒光的發(fā)射取決于配體的三重激發(fā)態(tài)T1能級的位置，及其與稀土離子激發(fā)態(tài)的能量匹配程度。

圖1 稀土(銪)配合物發(fā)光機(jī)理[32]當(dāng)稀土配合物受到紫外線照射時，有機(jī)配體的電子激發(fā)到第一激發(fā)單重態(tài) (S1)的振動能級。配合物分子經(jīng)歷快速分子內(nèi)轉(zhuǎn)換，如通過與溶劑分子的相互作用，躍遷到S1的較低振動能級。處于S1的電子可以經(jīng)輻射躍遷回到基態(tài) (S0)，也可以經(jīng)非輻射由單重態(tài)S1到三重態(tài)T1。處于三重態(tài)T1的電子可以通過自旋禁阻躍遷回到基態(tài)，并發(fā)射分子磷光。除此之外，配合物分子也可從三重態(tài)T1經(jīng)非輻射方式躍遷到稀土離子的激發(fā)態(tài)。經(jīng)這種分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移的間接激發(fā)后，處于稀土離子激發(fā)態(tài)的電子會以輻射躍遷到較低的4f能級，并產(chǎn)生稀土離子的特征光譜，或以非輻射躍遷方式回到基態(tài)Fig.1 Schematic diagram for the radiative processes of the chelate leading to Eu3+fluorescence[32] Upon irradiation with ultraviolet radiation,the organic ligands of the lanthanide complex are excited to a vibrational level of the first excited singlet state.The molecule undergoes fast internal conversion to lower vibrational levels of the S1state,for instance,through interaction with solvent molecules.The excited singlet state can be deactived radiatively to the ground state or can undergo nonradiative intersystem crossing from the singlet state S1to the triplet state T1.The triplet state T1can be deactivated radiatively to the ground state,by the spinforbidden transition.This results in molecular phosphorescence.Alternatively,the complex may undergo a nonradiative transition from the triplet state to an excited state of the lanthanide ion.After this indirect excitation by energy transfer,the lanthanide ion may undergo a radiative transition to a lower 4f state by characteristic line-like photoluminescence or may be deactivated by nonradiative processes

稀土配合物的發(fā)光特點

由于稀土配合物具有特殊的發(fā)光機(jī)理，因此，其熒光與羅丹明熒光素等常見的有機(jī)染料分子相比具有以下不同的特點[33]：1)稀土配合物的熒光發(fā)射波長與中心的稀土離子有關(guān)，而與配體的具體結(jié)構(gòu)關(guān)系不大。配體的作用是吸收激發(fā)光的能量并將能量轉(zhuǎn)移給稀土離子。因此，同一種稀土離子無論與何種配體絡(luò)合，熒光發(fā)射峰的形狀和發(fā)射波長是基本不變的；2)稀土配合物熒光的Stokes位移 (最大吸收峰與最大發(fā)射峰之間的波長差)比較大，一般在200 nm以上。該特點有利于進(jìn)行波長的分辨，同時也有利于避免因激發(fā)光而導(dǎo)致的散射光對熒光測定的干擾；3)稀土配合物的熒光發(fā)射峰較窄，半峰寬一般在10～15 nm左右，這一特點有利于提高分析測定的靈敏度和選擇性；4)由于稀土配合物所產(chǎn)生的熒光是延遲熒光，其熒光壽命比較長 (約1 ms)，是通常生物背景熒光壽命的105～106倍。利用這種長壽命的熒光，可進(jìn)行時間分辨熒光顯微成像測定和熒光壽命成像，從而有效避免背景熒光的干擾，提高測定靈敏度。

細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)的成像分析

細(xì)胞內(nèi)的小分子，包括各種活性氧分子 (單線態(tài)氧1O2、過氧化氫H2O2、超氧負(fù)離子自由基O2－等)和金屬離子 (如Zn2+、Cu2+、Mg2+和Ca2+等)，調(diào)控著細(xì)胞的代謝與功能，因此在細(xì)胞內(nèi)起著非常重要的作用[34]。實現(xiàn)活體細(xì)胞內(nèi)各種生物活性小分子和離子的實時在線動態(tài)檢測，對生命科學(xué)研究與發(fā)展具有重要的價值。

Song等[35,36]分別以蒽環(huán)和甲基蒽作為單線態(tài)氧的選擇性識別基團(tuán)，以三吡啶的羧酸衍生物為配體設(shè)計了兩種基于銪的配合物探針 (ATTA-Eu3+和MTTA-Eu3+)，并將MTTA-Eu3+探針成功用于HeLa細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧的成像。在此基礎(chǔ)上，該研究組又將原來的三吡啶配體改為兩個吡唑連接一個吡啶，設(shè)計了鋱的探針 (PATA-Tb3+)，同樣利用蒽環(huán)來識別單線態(tài)氧[37]。該研究組還設(shè)計了鋱/銪共摻雜型的時間分辨熒光探針 〔Eu3+/Tb3+(DTTA)〕，并用于細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝酸根識別及成像測定[38]。該探針基于同一激發(fā)條件下兩種稀土粒子各自發(fā)射不同顏色熒光的特點 (鋱離子為藍(lán)色/銪離子為紅色)，以及過氧亞硝酸根對鋱離子熒光的選擇性淬滅，通過探針的顏色變化 (由藍(lán)變紅)指示細(xì)胞中的過氧亞硝酸根濃度。

Zn2+是生物體內(nèi)必需的金屬離子，它的新陳代謝紊亂會引起諸多疾病。因此，細(xì)胞內(nèi)Zn2+的檢測也是人們研究的熱點。Ye等[39]設(shè)計了以鋱離子為中心離子的稀土配合物，合成了針對Zn2+的探針 (BBATA-Tb3+)，同樣應(yīng)用于HeLa細(xì)胞內(nèi)Zn2+的成像分析。與之類似，Hanaoka等[40]設(shè)計了一種以稀土銪離子為中心離子、二乙基三胺五乙酸 (DTPA)為配體的稀土配合物，并在此基礎(chǔ)上接枝Zn2+螯合基團(tuán)雙 (2-吡啶甲基)胺來制備Zn2+探針 (Eu-7)，并將其用于HeLa細(xì)胞內(nèi)Zn2+的成像分析 (圖2)。隨后，該研究組又設(shè)計了一種新型的銪、鋱共摻雜的時間分辨熒光成像體系以提高檢測靈敏度，并利用此成像系統(tǒng)成功實現(xiàn)了探針Eu-7在HeLa細(xì)胞內(nèi)針對Zn2+的時間分辨熒光成像[41]。該成像體系一方面利用稀土銪熒光壽命長的特點有效消除細(xì)胞內(nèi)背景熒光的干擾，另一方面，在同一激發(fā)光下可以實現(xiàn)銪、鋱兩種稀土配合物的雙色成像，為實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)的實時原位動態(tài)測定提供了新的途徑。

圖2 HeLa細(xì)胞內(nèi)Zn2+濃度的時間分辨熒光成像結(jié)果[40]測試所用激發(fā)光譜在(360±40)nm，發(fā)射光譜在(617±37)nm，間隔時間為30 s。時間分辨熒光成像由時間分辨長壽命發(fā)光顯微鏡系統(tǒng)(TRLLM)完成，弛豫時間為 70 μs，光路開啟時間為808 μs。將HeLa細(xì)胞用HBSS清洗兩次，隨后分散在HBSS緩沖液中。將[Eu-7]溶解于HBSS緩沖液中，使用Eppendorf注射系統(tǒng) (Transjector 5246)注射到HeLa細(xì)胞中。(A)0 min的明場照片；(B)0 min的時間分辨熒光照片；(C)5 min的時間分辨熒光照片 (向體系中加入5 μmol/L 吡啶硫酮以及 50 μmol/L ZnSO43 min 后)；(D)10 min 的時間分辨熒光照片 (向體系中加入100 μmol/L TPEN 7.5 min后)；(E)(B～D)所對應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度變化曲線Fig.2 Bright-field transmission and luminescence images of Zn2+in [Eu-7]-injected HeLa cells in HBSS buffer[40] The luminescence at(617±37)nm,excited at(360±40)nm,was measured at 30 s intervals.The cells were then washed with HBSS buffer and injected with[Eu-7]solution with an Eppendorf injection system(Transjector 5246). (A) Bright-field transmission image(0 min);(B)Luminescence image of(A)(0 min);(C)Luminescence image(5 min) following an addition of50 μmol/L pyrithione (zinc ionophore) and 150 μmol/L ZnSO4to themedium at3 min;(D)Luminescence image (10 min) following an addition of 150 μmol/L TPEN to the medium at 7.5 min.(E)Luminescence images(B～D)correspond to the luminescence intensity data,which shows the average intensity of the corresponding area or cell area(1,extracellular region;2,intracellular region of the injected cell;3,4,intracellular regions of noninjected cells)

生物大分子的成像分析

稀土配合物熒光探針除了用于細(xì)胞內(nèi)小分子的成像分析，在生物大分子的測定分析方面應(yīng)用也非常廣泛。Vaisanen等[42]以銪的螯合物作為熒光標(biāo)記物，采用時間分辨熒光成像方法實現(xiàn)了對單個前列腺特異抗原分子的可視化檢測。Connally等[43]報道了利用時間分辨熒光顯微鏡成像技術(shù)檢測濃縮水樣中的病源微生物Cryptosporidium和Giardia。他們首先將BHHST-Eu3+配合物分別標(biāo)記上抗Cryptosporidium單抗和羊抗鼠二次抗體，然后分別與濃縮水樣中的Cryptosporidium和經(jīng)單抗預(yù)處理過的Giardia共同孵育，最后進(jìn)行時間分辨熒光成像檢測。結(jié)果顯示，水樣中雜質(zhì)的強(qiáng)背景熒光被完全消除，檢測信噪比提高了10倍。Wu[44]和Jiang[45]等對BHHST-Eu3+化合物進(jìn)行了改進(jìn)，使所得到的時間分辨熒光探針可以在可見光波段激發(fā)，從而減少了激發(fā)光源的高能量對樣品的潛在傷害，拓展了該類探針的適用范圍，并成功地用于水樣中Giardia lamblia、Cryptosporidium muris及Cryptosporidium parvium的成像測定。

細(xì)胞標(biāo)記成像

作為細(xì)胞內(nèi)的成像探針，必須滿足以下條件：1)良好的水溶性；2)在生理條件下具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性；3)良好的膜穿透性和較低的細(xì)胞毒性；4)有較低的激發(fā)能量和較高的熒光量子產(chǎn)率。

Yu等[46]設(shè)計了一種以1-氮雜硫代呫噸酮為配體的銪離子稀土配合物，成功地對NIH-3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)的活細(xì)胞和固定后的細(xì)胞進(jìn)行了熒光顯微成像，通過細(xì)胞存活實驗，對探針的毒性進(jìn)行了驗證。共定位實驗也證明了該探針對細(xì)胞核的選擇性。在此探針基礎(chǔ)上，他們又通過改變配體上的取代基設(shè)計了一種pH熒光探針，并應(yīng)用于NIH-3T3細(xì)胞的熒光成像[47]。

由于雙光子熒光顯微成像所具有的低能量激發(fā)、避免光漂白、降低組織自發(fā)熒光及暗場成像等諸多特點，除了具有單一稀土元素的配合物探針在活細(xì)胞內(nèi)成像的應(yīng)用，具有雙光子熒光性質(zhì)的稀土配合物探針也在逐步應(yīng)用到細(xì)胞的成像分析中[48,49]。Picot等[50]以帶有聚乙烯基乙二醇鏈的烷氧基苯乙炔修飾的吡啶二羧酸 (配體L)合成了雙光子激發(fā)的水溶性銪配合物[Na]3[Eu(L)3]，并將其應(yīng)用于人膀胱癌T24細(xì)胞的雙光子激發(fā)顯微成像。從細(xì)胞圖片可明顯看出配合物分布在細(xì)胞核的周圍，其分布同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布相似。這一研究為設(shè)計能夠?qū)崟r動態(tài)檢測細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)的探針提供了強(qiáng)有力的支持。最近，Lam等[51]合成了可用于三光子顯微成像的鋱配合物探針[TbL(NO3)3](其中L為帶有甲氧基苯胺的配體)，并將其成功用于A549細(xì)胞 (人肺癌細(xì)胞)、HONE1細(xì)胞 (人鼻咽癌細(xì)胞)及HeLa細(xì)胞的成像分析(圖 3)。

圖3 人類肺癌細(xì)胞A549(A)和人類宮頸癌細(xì)胞HeLa(B)的三光子共聚焦熒光顯微照片[51]測試前將上述細(xì)胞浸潤在Tb3+配合物溶液(含有20 μg/mL培養(yǎng)基)中1 h；測試的激發(fā)光波長為800 nm，圖中顯示的為Tb3+在480 nm的綠色熒光Fig.3 Three-photon confocalfluorescent microscopy images of human lung carcinoma A549(A)and human cervical carcinoma HeLa cells (B)[51] The cellswere exposed to the terbium complexes for 1 h before the imaging experiment(20 μg/mL in thegrowth medium,λex=800 nm,filter band-pass for emission 480～615 nm),showing the Tb3+emission above 480 nm(green)

稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換材料在熒光成像領(lǐng)域的應(yīng)用

稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子

稀土上轉(zhuǎn)換熒光輻射是指利用摻雜于固體晶格的稀土離子，將兩個或兩個以上的低能量 (長波長)光子疊加并轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€高能量 (短波長)光子的過程[52]。該類材料通常由基質(zhì)和激活劑組成?；|(zhì)一般是稀土化合物或堿土金屬化合物組成的絕緣體，激活劑一般是微量摻雜的一種或多種稀土離子。通常所說的上轉(zhuǎn)換熒光指的是在紅外光激發(fā)下能發(fā)出波長在可見和紫外區(qū)域的光子的熒光輻射。

稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子是一種具有典型的高轉(zhuǎn)換效率的多光子熒光探針，同時具備了稀土離子上轉(zhuǎn)換發(fā)光的特性和納米尺度對生物體低損傷的特性。它的激發(fā)光源一般在紅外區(qū)域，有效地避免了紫外激發(fā)對細(xì)胞或組織長時間照射造成傷害的問題[53]。另外，大部分生物分子對紅外光幾乎沒有吸收，因而利用它可以實現(xiàn)深層生物組織的無背景高靈敏度探測[54]。與先進(jìn)的雙光子量子點相比，上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子具有更高的熒光發(fā)射效率，如NaYF4:Yb3+/Er3+上轉(zhuǎn)換納米粒子比目前最好的雙光子量子點的效率要高107倍[55]。同時，與雙光子量子點不同，利用商用便宜的連續(xù)發(fā)光二極管紅外激光器，就可以實現(xiàn)強(qiáng)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光。這一優(yōu)點極大地推動了上轉(zhuǎn)換納米粒子的廣泛應(yīng)用。此外，上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)射的譜帶很窄，其半峰寬可以跟量子點相比，且通過摻雜不同的稀土離子，可以像量子點一樣實現(xiàn)多色發(fā)射 (圖4)。

圖4 上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)光(如箭頭所示)照片 〔DMSO為溶劑，1 wt%，使用激發(fā)波長為 974 nm(10270 cm－1)、功率為5.9 kW/cm的激光作為激發(fā)源〕[55](A)NaYF4:20%Yb3+/2%Er3+樣品的上轉(zhuǎn)換熒光照片；(B,C)上述樣品分別在紅色和綠色濾光片下的發(fā)光照片；(D)NaYF4:20%Yb3+/2%Tm3+樣品的上轉(zhuǎn)換熒光照片F(xiàn)ig.4 Photographs ofthe UC luminescence in 1 wt% colloidal solutions of nanocrystals in dimethyl sulfoxide(DMSO)excited at 10270 cm－1with a laser powerintensity of5.9 kW/cm[55] (A) TotalUC luminescence of the NaYF4:Yb/Er(20/2 mol%)sample;(B,C) The same luminescence through red and green color filters,respectively;(D)Total UC luminescence of the NaYF4:Yb/Tm(20/2 mol%)sample

稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子在細(xì)胞與組織成像中的應(yīng)用

熒光成像由于其時間和空間分辨率較高，已經(jīng)成為臨床應(yīng)用和生物研究中非常重要的技術(shù)[56]。傳統(tǒng)的熒光成像都是基于紫外光激發(fā)，但是長時間的紫外光照射會對DNA造成傷害或引起細(xì)胞死亡，同時生物組織本身在紫外激發(fā)下會產(chǎn)生明顯的自身熒光而導(dǎo)致檢測靈敏度降低[57]。上轉(zhuǎn)換熒光納米材料采用長波長激發(fā)，發(fā)射出短波長輻射，對組織傷害小，產(chǎn)生的自發(fā)熒光弱，而且可以滲入到組織內(nèi)較深的部位[58]。另外，就上轉(zhuǎn)換熒光納米材料自身而言，其晶體基質(zhì)中摻雜的稀土元素的毒性也較低[59,60]。上轉(zhuǎn)換納米材料的優(yōu)異特性，使其在細(xì)胞與活體標(biāo)記方面的應(yīng)用逐漸引起人們的關(guān)注。

Zijlmans等[61]采用有機(jī)染料和亞微米量級上轉(zhuǎn)換熒光顆粒，對前列腺組織切片進(jìn)行了標(biāo)記，并對比了染色后的圖像。對比實驗結(jié)果表明，上轉(zhuǎn)換熒光顆粒標(biāo)記前列腺組織的圖像沒有生物組織的背景熒光干擾，很容易辨別組織的分布及形狀，而有機(jī)染料標(biāo)記的組織有很強(qiáng)的自體熒光。Wang等[62]將溶劑熱法合成的NaYF4:Yb3+/Er3+納米粒子經(jīng)表面修飾后應(yīng)用于HeLa細(xì)胞的免疫標(biāo)記與成像。原理是：修飾后納米粒子表面的氨基在活化劑的作用下與CEAS抗體結(jié)合，利用CEAS抗體與細(xì)胞表面抗原的免疫反應(yīng)就可實現(xiàn)對HeLa細(xì)胞的標(biāo)記與成像。實驗中詳細(xì)考察了納米粒子對細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)孵育12 h后細(xì)胞的狀態(tài)仍然很好，而且隨著孵育時間的延長，標(biāo)記效果也更好。

稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子在活體成像中的應(yīng)用

Lim等[63]利用所合成的Y2O3:Yb3+/Er3+納米粒子成功地進(jìn)行了線蟲的標(biāo)記，標(biāo)記后的線蟲在熒光顯微鏡下體內(nèi)發(fā)出明顯的綠色熒光 (圖5)。同時，線蟲的掃描電鏡表征也證明了線蟲內(nèi)部納米粒子的存在。

圖5 C.elegans線蟲雙光子成像結(jié)果[63] 所用儀器為含有20×物鏡(Nikon，Melville，NY)和增強(qiáng)型 CCD相機(jī) (Princeton Instruments，Trenton，NJ)的熒光倒置顯微鏡。線蟲的表面熒光成像中使用了20 W紅外LED激光陣列以及定制的熒光濾光鏡 (Chroma technology，Rockingham，VT)。綠色為上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)光，紅色為背景光。線蟲在饑餓處理 0 h(A)、4 h(B)和24 h(C)后，形態(tài)并未出現(xiàn)顯著性差異Fig.5 Falsecolor two-photon imagesofC.elegansat 980 nm excitation with red representing the bright field and green for the phosphor emission[63] Imaging of the C. elegans by upconversion luminescence with IR excitation was performed using a inverted microscope with a 20×,0.4 NA microscope objective(Nikon,Melville,NY),coupled to an intensified CCD camera(Princeton Instruments,Trenton,NJ).The worms were imaged by a custom-made fluorescence filter set(Chroma technology,Rockingham,VT),and a 20-W infrared LED laser array.The worms were deprived of food over a period of 24 h,showing little or no change at 0 h(A),4 h(B),and 24 h(C)

Chatterjee等[64]首次將上轉(zhuǎn)換納米粒子應(yīng)用于動物深處組織的熒光成像 (圖6)。該研究組利用聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine，PEI)在NaYF4:Yb3+/Er3+納米粒子表面修飾氨基。合成好的PEI-NaYF4:Yb3+/Er3+納米粒子首先應(yīng)用于HT29細(xì)胞株 (人類結(jié)腸癌)和OVCAR3細(xì)胞株（卵巢癌）的標(biāo)記，并同時進(jìn)行細(xì)胞存活率試驗。在證明該納米粒子具有化學(xué)穩(wěn)定性好、生物毒性低等優(yōu)點后，將其注入小鼠體內(nèi)成像，并同時以量子點作為對比。結(jié)果表明，上轉(zhuǎn)換納米材料的熒光強(qiáng)度與穿透力都優(yōu)于量子點。

圖6 NaYF4:Yb/Er上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCN)與量子點(QD)小鼠成像結(jié)果[64]分別向麻醉過的Wistar大鼠腹股溝、背部和腹部的皮下注射100 ml的PEI/NaYF4:Yb/Er(4.4 mg/mL)和QD溶液。用980 nm的VA-II型全固態(tài)半導(dǎo)體 (DPSS)激光器 (當(dāng)前設(shè)置1.0 A)作為激發(fā)源，于暗室內(nèi)觀察發(fā)光情況，并使用CCD數(shù)碼相機(jī) (Sony)成像 (使用濾熱器消除近紅外散射)。通過注射針刺入深度估計注射深度。足部淺表皮膚熒光成像結(jié)果：透過(A)，未透過(B)；QD(C)與UCN(D)腹部熒光透射結(jié)果；UCN小鼠背部(E)與腿部(F)深層組織成像結(jié)果Fig.6 In vivo UCN and QD imaging of rat[64] Wistar rats were anaesthetized and fur was clipped at the groin,back,and abdomen;100 ml of PEI/NaYF4:Yb/Er nanoparticles(4.4 mg/mL) and QD was injected subcutaneously at these regions in different animals.Luminescence was observed in a darkened room by excitation with a 980 nm VA-II DPSS laser(current set 1.0 A)and recorded using CCD based digital camera(Sony)with heat filters to eliminate NIR scatter.The depth of injection was estimated from needle penetration.The rat which injected with quantum dots shows fluorescence through the translucent skin of the foot(A)and,but not through the thicker back skin(B)or abdomen(C).NaYF4:Yb/Er nanoparticles injected below abdominalskin (D), thigh muscles(E), orback skin (F) show luminescence.Quantum dots on a black disk in(A,B)are used as the control

Jalil等[65]合成了粒徑為30 nm左右的不同稀土摻雜的NaYF4納米粒子，并在納米粒子表面沒有接枝選擇性基團(tuán)的情況下，將其直接應(yīng)用于細(xì)胞和活體的實驗。實驗結(jié)果表明，細(xì)胞成像具有很高的信噪比，活體生物成像深度可達(dá)1 cm。

Kumar等[66]在有機(jī)相中合成了以NaYF4為基質(zhì)，Eu3+、Er3+、Yb3+、Gd3+為共摻雜劑，兼具上轉(zhuǎn)換熒光和順磁共振成像能力的納米粒子，將其表面進(jìn)行腫瘤特異性抗體功能化后應(yīng)用于癌細(xì)胞成像實驗。此探針不僅對癌細(xì)胞具有很高的特異性識別能力，而且具有很好的細(xì)胞相容性。

長余輝發(fā)光材料在熒光成像和傳感中的應(yīng)用

長余輝發(fā)光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，是指在激發(fā)光停止照射后物質(zhì)仍能夠持續(xù)發(fā)光的現(xiàn)象。長余輝發(fā)光材料不含有毒重金屬元素，可以在檢測和成像前激發(fā)，在免激發(fā)條件下實現(xiàn)生物傳感和成像，因而有效避免了原位激發(fā)產(chǎn)生的背景干擾。盡管長余輝發(fā)光材料擁有量子點所不具備的優(yōu)點，但直至最近才有將長余輝材料應(yīng)用于生物傳感和成像的報道。Chermont等[67]利用溶膠-凝膠方法高溫合成了具有近紅外熒光的硅酸鹽長余輝納米材料，并將其應(yīng)用于小鼠體內(nèi)成像 (圖7)。該方法成功地避免了傳統(tǒng)熒光分析方法中激發(fā)光源對生物體的潛在傷害，首次實現(xiàn)了生物體內(nèi)的“免激發(fā)”熒光成像。最近，我們課題組合成了聚乙烯亞胺包覆的Eu和Dy摻雜Ca1.86Mg0.14ZnSi2O7長余輝發(fā)光納米材料，并與甲胎蛋白(alfa-fetoprotein，AFP)抗體功能化的金納米粒子復(fù)合構(gòu)成有效的能量共振轉(zhuǎn)移體系。該納米復(fù)合物可以在免激發(fā)的條件下高靈敏和高選擇性地檢測血清中的AFP，并可視化監(jiān)測肝癌細(xì)胞生長過程中釋放的AFP[68]。

限制長余輝發(fā)光材料在生物傳感和成像中應(yīng)用的主要因素有：1)傳統(tǒng)的合成方法對反應(yīng)條件要求較高。無論高溫固相法、溶膠-凝膠法還是共沉淀方法，都需要高于1000℃的高溫煅燒，且需要弱還原氣氛。這對設(shè)備的要求較高，增加合成成本。2)材料的分散性較差。由于材料是硅酸鹽基質(zhì)的，特別是高溫煅燒的產(chǎn)品普遍顆粒較大、交聯(lián)度高，因而造成長余輝材料在水中的分散性較差，限制了其在生物體系中的應(yīng)用。3)表面功能化難度較大。傳統(tǒng)合成方法得到的硅酸鹽材料表面幾乎沒有官能團(tuán)，因此進(jìn)一步表面修飾以及高選擇性、高效率的生物活性分子 (如抗體、酶等)的接枝比較困難。4)對目標(biāo)物的響應(yīng)較差。由于長余輝材料本身的化學(xué)穩(wěn)定性較高，其熒光強(qiáng)度不易受到其他化學(xué)物質(zhì)的影響，這在降低了樣品中共存物對熒光干擾的同時，造成其對分析物濃度的變化不敏感，影響其在熒光傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，研究簡單、快速地制備硅酸鹽長余輝材料的方法，通過制備和后修飾等方法增加材料的生物相容性，以及通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移等手段提高材料對分析物的選擇性響應(yīng)，是這類材料在生物分析和成像領(lǐng)域發(fā)展的必由之路。

結(jié)論與展望

綜上所述，稀土化合物熒光探針由于具有熒光壽命長、發(fā)射峰半峰寬窄和Stokes位移大等發(fā)光性質(zhì)，得到了越來越廣泛的應(yīng)用。特別是納米技術(shù)與材料科學(xué)的發(fā)展，有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)稀土發(fā)光材料自身所存在的不足，為其在熒光檢測與成像領(lǐng)域的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

隨著熒光標(biāo)記領(lǐng)域研究的日益深入，如何提高稀土發(fā)光材料的生物相容性及對標(biāo)記物的敏感性與特異性，同時充分利用稀土發(fā)光材料自身所特有的化學(xué)穩(wěn)定性及熒光的高效性等多方面的特點，將是今后努力的方向。盡管在應(yīng)用中存在著這些難點,稀土發(fā)光材料作為一類新的熒光標(biāo)記物，將會對細(xì)胞生物學(xué)、光學(xué)成像及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。與先進(jìn)光學(xué)成像技術(shù)的結(jié)合，將使得實時、動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)和生物活體內(nèi)的分子活動成為可能,為揭示生命活動規(guī)律及研究疾病的發(fā)生、診斷、治療提供新技術(shù)和新方法，促進(jìn)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展。

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This work was supported by a grant from the"973'Program(2011CB707703)

Lanthanide Luminescence for Bioimaging

WU Boyue,YAN Xiuping
Research Center for Analytical Sciences,College of Chemistry,Nankai University,Tianjin 300071,China

Jan 30,2011 Accepted:Mar 14,2011

YAN Xiuping,Tel:+86(22)23504605,Fax:+86(22)23506075,E-mail:xiupingyan@gmail.com

Rare earth luminescent materials have long-life fluorescent emission,small full-width half-maximum(FWHM),and large Stokes shift,thereby have been receiving great attention in diverse applications,including fluorescence immunoassay,anion recognition,protein activity determination,nucleic acid detection.In this paper,the applications of rare earth complexes,lanthanide-doped upconversion nanoparticles,and persistent luminescence nanoparticles in bioimaging are reviewed,the main problems of the rare earth luminescent materials,particularly long persistent phosphors in fluorescent imaging are also discussed.

Lanthanide luminescence;Fluorescent imaging;Lanthanide complex;Upconversion luminescence;Persistent luminescence nanoaprticles

2011-01-30；接受日期：2011-03-14

“973”計劃項目(2011CB707703)

嚴(yán)秀平，電話：(022)23506075，E-mail：xiupingyan@gmail.com

Q-334

10.3724/SP.J.1260.2011.00289