丁 潔， 滕皋軍

東南大學醫(yī)學院，南京210009

基質金屬蛋白酶在動脈粥樣硬化易損斑塊中的分子影像學研究

丁 潔， 滕皋軍

東南大學醫(yī)學院，南京210009

大量研究表明，依賴Ca2＋、Zn2＋等金屬離子的基質金屬蛋白酶在動脈粥樣硬化斑塊處的表達與斑塊的穩(wěn)定性密切相關，易損斑塊處基質金屬蛋白酶表達水平增高。單光子發(fā)射體層成像、近紅外熒光成像、磁共振成像等分子影像學的方法，能夠動態(tài)無創(chuàng)地檢測動物模型動脈斑塊或人頸動脈斑塊切除后標本中基質金屬蛋白酶的表達水平，不僅可以提示疾病的發(fā)展進程，而且能夠評價藥物的治療效果。盡管大多數(shù)斑塊成像的分子影像學手段尚未達到臨床應用的階段，但合成多模態(tài)的分子探針，綜合運用各種不同的影像學方法將是動脈粥樣硬化斑塊成像的發(fā)展方向。

分子影像；基質金屬蛋白酶；斑塊破裂

引 言

心血管疾病日益威脅人類健康，現(xiàn)在普遍認為動脈粥樣硬化 (atherosclerosis，AS)斑塊的破裂以及隨之引起的血栓形成，是心血管疾病的主要致死原因。因此，斑塊性質的檢測，即明確是否為易損斑塊，對于患者個性化治療方案的制定具有指導作用。分子影像學可以利用單光子發(fā)射體層成像 (single photon emission computed tomography，SPECT)、近紅外熒光成像 (near-infrared fluorescence imaging，NIRF)、磁共振成像 (magnetic resonance imaging，MRI)等方法，檢測AS進程中相關分子的變化，對于斑塊性質的評價具有應用前景。

基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用，它能夠降解細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)，促進平滑肌細胞的遷移和增殖，促進粥樣斑塊“纖維帽”的降解，最終導致粥樣斑塊破裂，從而產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥。正是因為其在AS斑塊發(fā)展進程中的這一作用，MMPs作為成像靶標用于AS斑塊性質的鑒定倍受關注。

MMPs的性質

MMPs是由Gross等[1](1962年)在研究蝌蚪形態(tài)改變的發(fā)育過程中第一次發(fā)現(xiàn)的，因其酶活性需要Ca2＋、Zn2＋等金屬離子作為輔助因子而得名。MMPs是一個大家族，可由許多細胞 (如單核細胞、平滑肌細胞、泡沫細胞、T淋巴細胞等)合成并分泌至細胞外，特異性地與ECM的各種成分結合，降解ECM。在正常成人的組織中通常低水平表達MMPs，但在一些正?；虿±硇灾亟ǖ倪^程中，MMPs表達上調。根據(jù)作用的底物不同，MMPs可分為膠原酶 (MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)、明膠酶 (MMP-2、MMP-9)、基質分解素 (MMP-3、MMP-10）和膜型 MMP(MMP-14、MMP-15、MMP-16)等 4類。所有MMPs家族成員均有以下一些共同特性：1)可降解ECM成分；2)以酶原的形式分泌至細胞外，并在適當條件下激活而發(fā)揮生物學作用；3)酶的活性位點存在鋅離子，并需要鈣離子維持其活性與穩(wěn)定性；4)pH中性時發(fā)揮作用；5)可以被特異性組織金屬蛋白酶抑制因子 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs)所抑制。在此基礎之上，MMPs成員又各有特點，各種MMPs間具有一定的底物特異性。同一種MMPs可降解多種ECM成分，而某一種ECM成分又可被多種MMPs降解，不同酶的降解效率可不同。

大量的實驗研究證明：MMPs參與了人類的各種生理和病理過程，如胚胎的發(fā)育、形態(tài)學發(fā)生、血管新生、炎性反應、組織重建、器官纖維化，以及腫瘤侵襲轉移等[2]。

AS易損斑塊

AS是一個動態(tài)發(fā)展的過程，基本病理進程包括脂紋、纖維斑塊、粥樣斑塊和復合性病變。典型的AS斑塊主要由纖維帽和脂質核心兩部分構成。纖維帽由大量平滑肌細胞和ECM形成，厚薄不一；纖維帽下為大量泡沫細胞、脂質、巨噬細胞、壞死崩解物和鈣鹽等物質共同組成的脂質核心。根據(jù)是否容易破潰引發(fā)心血管事件，AS斑塊可分為穩(wěn)定性斑塊(stable plaque)和不穩(wěn)定性斑塊 (unstable plaque)。穩(wěn)定性斑塊主要由較厚的纖維組織構成、脂質核心較小、炎細胞浸潤較少，此種斑易發(fā)生破裂。不穩(wěn)定性斑塊又稱易損斑塊(vulnerable plaque)，其主要的特征有：偏心性的較大的脂質核心、纖維帽薄且有大量炎細胞浸潤、斑塊底部有較多的新生血管。這類斑塊具有破裂傾向，易于發(fā)生血栓，形成進展迅速的危險斑塊[3]?？梢?，AS斑塊的性質，即斑塊的厚度、脂質和纖維帽所占比例等，將決定著斑塊的穩(wěn)定與否，不同性質的斑塊預示著不同的結局。

MMPs與AS斑塊破裂的關系

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，AS易損斑塊的破裂是急性冠狀動脈綜合征 (包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、心源性猝死)的主要原因[4,5]。急性冠狀動脈綜合征多發(fā)生在冠狀動脈粥樣硬化但并非冠狀動脈十分狹窄的基礎上，其主要病理生理機制為粥樣斑塊破裂、血管痙攣和隨之發(fā)生的血小板黏附、聚集及繼發(fā)性血栓形成。在AS易損斑塊中，MMPs的合成及降解十分活躍，MMPs表達明顯增多。由于平滑肌細胞凋亡，數(shù)量減少，MMPs主要來源于巨噬細胞。這一過程受到一個依賴前列腺素E2(PGE2)/環(huán)腺苷的信號通路的調節(jié)，該通路是環(huán)氧化酶2(COX-2)和前列腺素合酶信號的下游分子。即在AS易損斑塊中，COX-2誘導的PGE2合成增強，PGE2可以誘導AS斑塊處的巨噬細胞產(chǎn)生更多的MMPs。有研究證實，在發(fā)作不穩(wěn)定型心絞痛和穩(wěn)定型心絞痛及正常狀態(tài)的內乳動脈中，MMP-9的表達分別為83%、25%及0[6]；易損斑塊，尤其是斑塊的肩區(qū)，MMPs活性明顯增加，較穩(wěn)定斑塊高3～5倍；在AS斑塊內和斑塊的破裂處均有MMP-2及MMP-9表達?，F(xiàn)在普遍認為，易損斑塊中由于炎性細胞增多，巨噬細胞、T淋巴細胞等可大量分泌MMPs作用于ECM，加快基質、膠原纖維的降解速度，使得動脈斑塊的纖維帽結構不穩(wěn)定，從而促進了斑塊破裂。因此MMPs的激活是導致AS斑塊不穩(wěn)定的重要因素[7,8]，MMPs的表達水平可以作為斑塊是否穩(wěn)定的一個預測指標。

MMPs在AS斑塊成像中的研究

目前常采用化學檢測法檢測血循環(huán)中MMPs的濃度，但這種方法不能準確反應粥樣硬化斑塊局部MMPs的表達。正因為MMPs與AS斑塊的破裂密切相關，監(jiān)測斑塊局部MMPs的表達情況顯得十分重要。而傳統(tǒng)的免疫組化、ELISA、Western blotting等方法存在著難以回避的局限性：需取得標本后，經(jīng)過離體取材、冰凍切片及染色過程，這難以全面、系統(tǒng)、完整、動態(tài)地觀察，更難以用于臨床檢測。因此，通過在體成像的方法來檢測AS形成過程中MMPs的表達，活體狀態(tài)下整體地追蹤觀察，并對同一實驗對象進行長期縱向動態(tài)的研究，對于AS的預防、早期診斷、疾病的分期和治療效果的判斷具有重要的臨床應用價值。

分子影像學 (molecular imaging)是在活體狀態(tài)下應用影像學方法，從細胞和分子水平對生物過程進行定性和定量研究的一門新興科學，主要有MRI、核醫(yī)學成像和光學成像三種成像方法 (見表1)。通過靶向性、高親和力的分子探針對病變分子成像，從而改變了傳統(tǒng)醫(yī)學影像學只能顯示解剖學和病理學改變的形態(tài)顯像能力。在AS的動物模型中，利用SPECT、NIRF、MRI等不同的成像方法，以在AS不穩(wěn)定斑塊中高表達的MMPs分子作為成像靶標，可以理想地監(jiān)測斑塊的進展并且評價藥物的治療效果。

表1 常見的分子影像學技術比較Table 1 The advantages and disadvantages of the various molecular imaging techniques

SPECT的影像學檢測

Schaferas等[9]用123I或125I結合MMPs廣譜抑制劑，通過SPECT成功檢測了ApoE－/－小鼠動脈粥樣硬化模型中活性MMPs的表達。Kopka等[10]也用125I結合MMP-2或MMP-9特異性抑制劑，通過SPECT檢測到了小鼠動脈粥樣硬化模型中MMPs的表達，同時還檢測了I125-抑制劑復合物在體內的分布，發(fā)現(xiàn)藥物主要分布在血循環(huán)，而且清除很快，對正常組織沒有副作用。Kuqe等[11]用放射性的99Tc標記MMP-1的單克隆抗體，對兔的主動脈斑塊進行成像，結果提示，在Ⅳ期斑塊中，放射性探針的蓄積為對照組的5.4倍，且在不穩(wěn)定性斑塊中探針的蓄積也超過穩(wěn)定性斑塊。Fujimoto等[12]在球囊擴張和高脂飲食所致的兔腹主動脈斑塊模型中，用99Tc標記MMPs的抑制劑MPI后進行SPECT成像，以評價這種非侵入性的檢查方法在粥樣斑塊成像方面的可行性，結果發(fā)現(xiàn)斑塊能夠攝取標記核素的MPI，且用他汀類藥物干預或者飲食控制脂類物質的含量后，斑塊對MPI的攝取量明顯降低。Satoru等[13]采用相同的兔腹主動脈斑塊模型，用99Tc標記MMPs的抑制劑MPI后，發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素干預后能夠持續(xù)降低斑塊處MMPs的表達水平，穩(wěn)定斑塊，且米諾環(huán)素的治療作用與他汀類藥物相當。

NIFR成像方法

光學成像具有分辨率高、靈敏度高、價格低廉等優(yōu)點，隨著納米技術的深入，基于納米顆粒、納米殼和量子點研發(fā)出各種類型的光學分子探針。NIFR是指靶向分子與近紅外熒光染料結合得到的光學探針，可在700～1000 nm接近紅外線的光區(qū)波長范圍內吸收光線，隨之可以發(fā)射出更大波長的光線，根據(jù)被儀器捕獲的光線強度的不同來進行成像。NIFR是光學成像的一種重要手段，它的分辨率可達到1～2 mm，能穿透厚8 cm的組織，熒光成像信號強。與可見光相比，它具有兩大優(yōu)點：較深的組織穿透力及較弱的自發(fā)熒光。

Deguchi等[14]用NIFR成像技術，檢測了ApoE－/－小鼠動脈粥樣硬化模型中活性MMPs的表達，發(fā)現(xiàn)這種在體成像技術可成功檢測動脈粥樣硬化模型中活性MMPs的表達，對動脈粥樣硬化病變的早期診斷、易損斑塊的檢測和治療效果的判斷，具有重要的臨床應用價值。Wallis等[15]也通過多光譜的NIFR成像技術，用MMPs敏感的激活型探針MMPSense 680，在體外檢測了患者手術切除的狹窄的頸動脈斑塊，結果很好地顯示出斑塊處MMP的分布情況，為易損斑塊的鑒別、藥物治療的效果，以及治療方法的選擇提供了很好的依據(jù)。

MRI成像方法

在動脈粥樣硬化斑塊的診斷中，由于具有高分辨率、無輻射、無創(chuàng)、可重復進行等優(yōu)點，MRI檢查可能成為一種理想的影像技術[16,17]。傳統(tǒng)的MRI檢查是利用斑塊內本身的物理、生理學特性作為成像對比的依據(jù)，其敏感性、特異性尚有待提高。分子水平的MRI是建立在上述傳統(tǒng)成像技術基礎上，以在MRI圖像上可顯像的特殊分子作為成像靶點，如利用粥樣斑塊中某些上調的分子 〔巨噬細胞清道夫受體 (macrophage scavenger receptor,MSR)等〕，結合MRI成像對比劑，得到特異性的分子探針，對這些分子在體內進行定位。

在各類MRI對比劑中，以釓 (gadolinium，Gd)劑和超順磁性氧化鐵 (superparamagetic iron oxide，SPIO)類最受關注[18]。Gd劑能縮短被引入組織的T1馳豫時間，增強組織的T1WI信號，對T2馳豫時間的影響較小。Lancelot等[19,20]將MMPs的抑制劑與Gd劑偶聯(lián)得到了MRI的分子探針P947，與非靶向性的增強劑Gd-DOTA相比，在富含MMPs斑塊的ApoE-/-小鼠中，P947的聚集明顯增加。結合組織學實驗和MRI的體外實驗也證實，無論是在高脂飲食喂養(yǎng)的兔的動脈斑塊處還是人頸動脈斑塊切除后的標本，P947均能很好地區(qū)分斑塊中MMPs的含量。SPIO是近年來研究較為熱門的一種磁共振增強劑，它的粒徑小，穿透力強，可明顯縮短T1、T2馳豫時間從而提高信噪比。同時，由于納米顆粒的比表面積大而使其表面活性增大，更易于對納米顆粒進行表面修飾，使其含有特定的活性基團，從而與特定的物質連接。經(jīng)過修飾的納米顆粒可具有或攜帶有治療性物質，可能使治療和診斷合二為一。且SPIO具有生物可降解性，能被細胞代謝后進入正常血漿鐵池，與紅細胞血紅蛋白結合或用于其他代謝過程，所以在MRI分子影像學應用研究中前景看好[21]。

總 結

本文主要介紹了MMPs與AS易損斑塊破裂的密切關系，及以MMPs為靶標采用不同的分子影像學方法在AS斑塊成像中的實驗研究結果。 MMPs在AS進程中的作用已相對明確，成為心血管病治療的一個靶點。目前，經(jīng)臨床應用發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物及血管轉化酶抑制劑可抑制MMP-9的活性，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用?；蛑委煼矫?，可以抑制MMPs的功能及抑制促進MMPs產(chǎn)生的有關因素，例如：應用TIMPs抑制MMPs的活性；以反義抑制的原理阻斷促炎分子PGE2等的表達；通過基因敲除降低機體局部MMPs的表達，穩(wěn)定AS斑塊，防治心血管事件的發(fā)生。這些技術方法都必須建立在實時準確評價病灶局部MMPs的水平之上。分子影像學在動脈粥樣硬化斑塊的成像中具有重要的意義和廣闊的前景，不斷有新的對比劑被研發(fā)出來，有些已進入人體臨床試驗或應用，但大部分還處于臨床前期的試驗階段，尚需要更加深入的研究才能達到臨床應用的階段。

不同的分子影像學檢測手段各有其優(yōu)缺點，單一的成像模態(tài)得到的生物體信息有限，難以滿足科研及臨床診斷的需要。將各種模態(tài)成像技術融合，綜合運用不同的方法，合成多模態(tài)的分子探針，采用多種成像方法，將是動脈粥樣硬化斑塊成像的發(fā)展方向。有可能真正實現(xiàn)個體患者的心腦血管病危險性預測，從而采取恰當?shù)念A防和治療措施，及時評價治療效果，最終實現(xiàn)個體化的醫(yī)療。

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Molecular Imaging of Matrix Metalloproteinases in Vulnerable Plaque in Atherosclerosis

DING Jie,TENG Gaojun
School of Medicine,Southeast University,Nanjing 210009,China

Nov 1,2010 Accepted:Mar 6,2011

TENG Gaojun,Tel:+86(25)83272121,E-mail:gjteng@vip.sina.com

Many researches indicate that the expression of matrix metalloproteinases(MMPs)in atherosclerotic plaques，whose activities involved with metal ions,such as Ca2＋or Zn2＋, is closely related to the stability of the plaques.There is an increased expression level of MMPs in vulnerable plaque.Molecular imaging methods,such assinglephoton emission computed tomography,near-infrared fluorescenceimaging and magnetic resonance imaging provide dynamic and noninvasive waysin detectting the expression level of MMPs in the atherosclerosis plaque in the animal models or the tissue after carotid ectomy in patients.These methods can be used not only in prompting the progression of atherosclerosis but also evaluating the therapeutic effect of drugs.Although the majority of plaque imaging methods has not yet reached the stage of clinical application,the synthesis of multi-modality molecular probes and comprehensive use of different imaging methods will be the trend of atherosclerotic plaque imaging.

Molecular imaging;Matrix metalloproteinase;Plaque rupture

2010-11-01；接受日期：2011-03-06

滕皋軍，電話：(025)83272121，E-mail：gjteng@vip.sina.com

R445.4

10.3724/SP.J.1260.2011.00312