混料設(shè)計優(yōu)化復(fù)合酶水解水酶法提取大豆油工藝

李 楊，江連洲*，王中江，王 辰，李丹丹，王文睿

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

混料設(shè)計優(yōu)化復(fù)合酶水解水酶法提取大豆油工藝

李 楊，江連洲*，王中江，王 辰，李丹丹，王文睿

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

利用混料優(yōu)化設(shè)計對最適合水酶法提取大豆油脂的復(fù)合酶配比條件和水解條件進行優(yōu)化，以總油提取率為指標(biāo)，確定復(fù)合酶水解的水酶法提取大豆油脂和蛋白工藝最優(yōu)條件。結(jié)果表明，料水比1:6(g/mL)、纖維素酶添加量0.84%、半纖維素酶添加量0.56%、酶解pH5、酶解溫度37℃條件下水解0.75h后，再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶，加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解pH9.26、水解3.6h，總油提取率達到極大值即81.04%，比以往國內(nèi)研究采用濕熱處理工藝有很大提高。

水酶法；復(fù)合酶；大豆油；混料設(shè)計

植物細胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠組成，油脂存在于油料籽粒細胞中，并通常與其他大分子(蛋白質(zhì)和碳水化合物)結(jié)合，構(gòu)成脂多糖和脂蛋白等復(fù)合體，只有將油料組織的細胞結(jié)構(gòu)和油脂復(fù)合體破壞，才能提出其中的油脂。水酶法提油技術(shù)是在機械破碎的基礎(chǔ)上，采用對油料組織以及脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體有降解作用的酶(如纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶、葡聚糖酶等)處理油料，通過酶對細胞結(jié)構(gòu)的進一步破壞，以及酶對脂蛋白、脂多糖的分解作用，增加油料組織中油的流動性，從而使油游離出來[1]。與傳統(tǒng)工藝相比，水酶法提油技術(shù)設(shè)備簡單、操作安全、效率高；所得的毛油質(zhì)量高、色澤淺、易于精煉；處理條件溫和，能生產(chǎn)出脫毒的蛋白產(chǎn)品；生產(chǎn)過程能耗相對較低；廢水中BOD與COD值大為下降，污染少、易處理。同時，酶的專一性，決定采用單一純酶在酶解工藝中有很大局限性，因此，選擇幾種合適酶混合使用，將會使細胞降解更徹底、效果更好，混合酶應(yīng)用商品化愈來愈受到油脂界關(guān)注。

近些年相關(guān)專家已經(jīng)利用復(fù)合酶水解法從葵花籽、菜籽、芝麻、玉米胚芽等油料作物中成功提取油脂[2-6]。大豆細胞壁的主要組成成分是纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì)，因此實驗中多選取纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶水解后，再利用蛋白酶水解提取大豆油脂。例如，Rosenthal等[7]采用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶作用于121℃處理8min的大豆，發(fā)現(xiàn)纖維素酶與蛋白酶作用效果較好，采用響應(yīng)面分析方法對參數(shù)進行優(yōu)化，油得率為58.7%，而不用酶處理的油得率僅為41.8%。但假如大豆粉不經(jīng)熱處理，加酶后的體系油得率反而低于不加酶作用的體系。張巖春等[8]采用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計的數(shù)學(xué)方法優(yōu)化纖維素酶、果膠酶和蛋白酶在提取大豆油時的配比，得出結(jié)論：以纖維素酶占32.95%、果膠酶占47.86%、蛋白酶占19.32%的配合比時復(fù)合酶的破壁能力最強，有利于油脂從油料組織中釋放。鑒于不同的實驗方案及數(shù)據(jù)處理方法得到的復(fù)合酶配比和水解條件的不同，本實驗采用混料設(shè)計的數(shù)學(xué)方法研究復(fù)合酶(纖維酶、半纖維酶、果膠酶)配比對水酶法提取大豆油脂的影響規(guī)律，并且對最適合水酶法提取大豆油脂復(fù)合酶配比和水解條件進行優(yōu)化，通過對該法提取的大豆油脂品質(zhì)的研究，進一步指導(dǎo)對大豆油脂提取方法的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆為黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院培植的墾農(nóng)42(蛋白質(zhì)含量41.6%、油脂含量21.3%、含水率10.6%、灰分4.3%)。纖維素酶(酶活1.5×104U/g)、半纖維素酶(酶活1.5×103U/g)、果膠酶(酶活5×104U/g) 美國Sigma公司；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶(酶活1.2×105U/mL) 丹麥Novo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F2102型植物試樣粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；LDZ5-2型臺式低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；KDN-04 Ш型蛋白質(zhì)測定儀 上海纖檢儀器有限公司；JJ-1型精密電動攪拌機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；PHS-3C酸度計 上海鵬順科學(xué)儀器有限公司。

1.3 指標(biāo)測定方法

水分的測定：依據(jù)GB/T 14489.1—2008《油料水分及揮發(fā)物含量測定》；粗蛋白的測定：依據(jù)GB/T 14489.2—2008《糧油檢驗：植物油料粗蛋白質(zhì)的測定》；灰分測定：依據(jù)GB/T 5505—2008《糧油檢驗：灰分測定法》；大豆油品質(zhì)：依據(jù)GB 1535—2003《大豆油》；粗脂肪：GB/T 5512—2008《糧油檢驗：糧食中粗脂肪含量測定》中索氏抽提法進行測定；大豆油脂的品質(zhì)鑒定：依據(jù)GB 1535—2003《大豆油》。

1.4 水酶法提取大豆油的工藝流程

1.5 實驗方案的確定

本實驗所用纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶均為Sigma公司生產(chǎn)，通過查閱相關(guān)文獻和預(yù)實驗最終確定3種酶聯(lián)合作用的最佳pH5、最佳酶解溫度37℃，故本實驗研究中，酶解溫度和酶解pH值固定為此參數(shù)[4]。在纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶不同配比條件下水解后，在最優(yōu)條件下利用堿性蛋白酶再次水解，考察總油提取率。

在模糊評判優(yōu)化的堿性蛋白酶最優(yōu)酶解條件下進行酶解，即酶解工藝參數(shù)為加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解時間3.6h、料水比1:6、酶解pH9.26。根據(jù)前人的研究，實驗原料的粒度采用錘片式粉碎機過3mm篩板的處理方式[9-15]。

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在各種酶的最佳加酶量和酶解時間下(纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶的最佳加酶量分別為質(zhì)量分數(shù)1%、0.5%、1%，最佳酶解時間均為1h)，通過混料設(shè)計法進行過程優(yōu)化。以A(纖維素酶添加量)、B(半纖維素酶添加量)、C(果膠酶添加量)、D(復(fù)合酶水解時間)分別代表的因素為自變量，以總油提取率為因變量，其因素水平編碼表見表1。

表1 大豆油提取工藝優(yōu)化試驗因素水平編碼表Table 1 Coded factors and their coded levels in central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶最佳配比的確定

表2 混料設(shè)計試驗安排及結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of central composite design

應(yīng)用混料設(shè)計法進行過程優(yōu)化，混料設(shè)計試驗方案及結(jié)果見表2。

通過統(tǒng)計分析軟件Design Expert進行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型如下：

R=72.12A＋71.89B＋69.58C＋68.56D＋35.27AB＋26.65AC＋23.83AD＋14.43BC＋9.9BD＋23.19CD＋20.58ABC＋68.16ABD－38.94ACD－295.05BCD

回歸與方差分析結(jié)果見表3，交互作用的等高線分析圖見2，混料設(shè)計優(yōu)化結(jié)果見圖3。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for the established regression equation

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.001)，失擬項不顯著，并且該模型R2=93.19%，R2Adj=84.35%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗可以得到因子貢獻率為AB＞AC＞BC，即纖維素酶與半纖維素酶混合作用水解＞纖維素酶與果膠酶混合作用水解＞半纖維素酶與果膠酶混合作用水解。

圖1 混料設(shè)計因素交互項對總油提取率的等高線分析Fig.1 Contour plots for the effects of pairwise interactions among four factors on oil extraction efficiency

由圖1分析結(jié)果可看出，A(纖維素酶添加量)、B(半纖維素酶添加量)、C(果膠酶添加量)、D(復(fù)合酶水解時間)的交互作用對總油提取率的影響。由圖1a和圖1b中可以看出當(dāng)纖維素酶和半纖維素酶添加按照1:1配比添加附近有較大值出現(xiàn)，說明在實驗中添加果膠酶對總油提取率影響不大。由圖1b、1c和圖1d可以看出當(dāng)酶解時間過長，總油提取率反而下降，分析原因是水解pH值在酸性條件下，水解時間延長導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性不利于后期蛋白酶水解蛋白質(zhì)，從而影響油脂釋放。

圖2 復(fù)合酶配比對總油提取率的混料設(shè)計優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Effect of enzyme loading on the extraction rate of total oil

由圖2可知，纖維酶素與果膠酶共同水解作用對總油提取率的提高不明顯，半纖維素酶與果膠酶的共同水解作用對總油提取率的提高不明顯。通過混料設(shè)計結(jié)果的優(yōu)化可知當(dāng)復(fù)合酶酶解時間大于0.33水平即45min時，果膠酶添加量為0.004(添加量較小對油脂提取率影響不顯著，可化簡為0)，纖維素酶添加量水平值0.419，半纖維素酶添加量水平值0.266，此時總油提取率有較大值在81.15%左右。根據(jù)因素水平編碼表(表1)換算，得到最優(yōu)復(fù)合酶水解工藝為纖維素酶添加量0.84%、半纖維素酶添加量0.4%，兩種酶在pH5條件下復(fù)合水解45min后，再利用堿性蛋白酶在最優(yōu)條件下水解3.6h，可使總油提取率達到81.15%左右。

2.2 驗證實驗

通過對復(fù)合酶(纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶)不同配比水解工藝參數(shù)對各考察指標(biāo)影響的混料實驗研究，得到了總油提取率提取率的優(yōu)化值。在兩個考察指標(biāo)最優(yōu)的復(fù)合酶水解工藝條件下，進行5次驗證實驗取平均值，結(jié)果見表4。由表4可知，在最優(yōu)復(fù)合酶水解條件下各考察指標(biāo)的驗證值與預(yù)測值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差均在合理范圍內(nèi)，說明響應(yīng)值的驗證實驗值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。兩個考察指標(biāo)均可在混料設(shè)計優(yōu)化的復(fù)合酶配比水解工藝條件下，得到較大的提取率。由此結(jié)果可以看出，在纖維素酶添加量為0.84%時，總油提取率達到極大值即81.04%，比以往國內(nèi)研究采用濕熱處理工藝有很大提高。最終確定最優(yōu)復(fù)合酶水解水酶法提取大豆油脂工藝條件為料水比1:6、纖維素酶添加量0.84%、半纖維素酶添加量0.4%、酶解pH5、酶解溫度37℃條件下水解0.75h后，再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶，加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解pH9.26、水解3.6h。

表4 驗證實驗結(jié)果Table 4 Results of validation experiments under optimized hydrolysis conditions

2.3 油脂品質(zhì)鑒定

水酶法制取工藝和傳統(tǒng)工藝相比，得到的油沒有溶劑殘留且工藝條件溫和，并能保持良好的品質(zhì)。本實驗針對復(fù)合酶水解水酶法提取工藝(最優(yōu)參數(shù)條件下制取油脂)，蛋白酶水解水酶法工藝及傳統(tǒng)溶劑萃取工藝得到的大豆油脂品質(zhì)進行了比較和分析，其結(jié)果見表5。

表5 不同工藝大豆油質(zhì)量比較Table 5 Quality comparison among soybean oils extracted by different methods

通過表5的實驗結(jié)果與GB 1535—2003《大豆油》中大豆油品質(zhì)等級指標(biāo)對比研究可知，復(fù)合酶水解水酶法提取的大豆油無需精煉即可達到二級大豆油的標(biāo)準(zhǔn)。

由表6可知，復(fù)合酶水解水酶法、蛋白酶水解水酶法及溶劑浸出工藝制取的大豆油脂中脂肪酸組成接近(復(fù)合酶水酶法的油酸含量略高)，大豆油中VE含量差異不顯著(溶劑浸出法的VE含量略高)，結(jié)果表明不同的制取工藝對所得大豆油中脂肪酸組成及大豆油中VE含量影響不顯著。

表6 不同工藝的大豆油脂肪酸組成與VE含量Table 6 Comparisons on fatty acid composition and vitamin E contents in soybean oils extracted by different methods

3 結(jié) 論

大豆細胞壁的主要組成成分是纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì)，本實驗研究了纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶水解后，再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶水解提取大豆油脂工藝。通過實驗發(fā)現(xiàn)，不同的復(fù)合酶(纖維酶、半纖維酶、果膠酶)配比水解工藝條件對后期Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶的水酶法提取大豆油脂的提取率影響較大。

本實驗利用混料優(yōu)化設(shè)計對最適合水酶法提取大豆油脂復(fù)合酶配比和水解條件進行優(yōu)化。確定最優(yōu)復(fù)合酶水解水酶法提取大豆油脂工藝條件為料水比1:6、纖維素酶添加量0.84%、半纖維素酶添加量0.4%、酶解pH5、酶解溫度37℃條件下水解0.75h后，再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶，加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解pH9.26、水解3.6h。利用以上工藝方法，總油提取率可達到極大值81.04%，比以往國內(nèi)研究采用濕熱處理工藝有很大提高。經(jīng)過對大豆油脂品質(zhì)鑒定，可知所提取的大豆油可達到二級大豆油的標(biāo)準(zhǔn)。

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Mixed Design Optimization of Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Oil with Enzyme Complex

LI Yang，JIANG Lian-zhou*，WANG Zhong-jiang，WANG Chen，LI Dan-dan，WANG Wen-rui
(School of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Cellulose, hemicellulase and were simultaneously used for the aqueous enzymatic extraction of soybean oil by in the present study, and the extraction process was optimized by mixed design. It was found that the optimal hydrolysis process for soybean oil extraction consisted of suspending of soybean powder in a 6-fold volume of water, adding 0.84% cellulose and 0.56% hemi-cellulase for hydrolysis at 37 ℃ for 0.75 h, and further hydrolysis with Alcalase added at a concentration of 1.85% for 3.6 h at 50 ℃with an initial pH of 9.26, and provided an oil extraction efficiency of 81.04%, which was higher than that of wet-heating treatment extraction.

enzymatic hydrolysis method；compound enzyme；soybean oil；mixed design

TS214.2

A

1002-6630(2011)06-0066-05

2010-09-23

黑龍江省科技攻關(guān)項目(GA09B401-6)

李楊(1981—)，男，博士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：liyanghuangyu@163.com

*通信作者：江連洲(1960—)，男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com