序貫設(shè)計(jì)優(yōu)化佛手瓜汁生產(chǎn)細(xì)菌纖維素工藝

李家洲，肖玉平，黃榮林，趙 鑫

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300)

序貫設(shè)計(jì)優(yōu)化佛手瓜汁生產(chǎn)細(xì)菌纖維素工藝

李家洲，肖玉平，黃榮林，趙 鑫

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300)

在以佛手瓜汁為原料利用木醋桿菌(Acetobacter xylinus)發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的過程中，利用Plackett-Burman分部析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定出蔗糖質(zhì)量濃度和pH值對(duì)產(chǎn)量具有顯著影響，再利用最速爬坡試驗(yàn)確定出這兩個(gè)因素的中心點(diǎn)，最后以中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立試驗(yàn)空間下的模型，優(yōu)化出最佳的因素水平為溫度28℃、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度0.3g/100mL、佛手瓜汁用量(體積分?jǐn)?shù))100%、蔗糖質(zhì)量濃度6.54g/100mL、pH4.19。在最優(yōu)條件下可得最大干基產(chǎn)量為4.18g/L。

佛手瓜汁；細(xì)菌纖維素；序貫設(shè)計(jì)

佛手瓜(Chayotes，Sechium edule)，葫蘆科佛手瓜屬栽培種，又名隼人瓜、菜肴梨、合掌瓜、拳頭瓜等，多年生攀緣性草本植物。原產(chǎn)墨西哥和中美洲，18世紀(jì)傳入歐洲，后傳入東南亞，20世紀(jì)初自緬甸傳入我國南方地區(qū)，在我國江南地區(qū)種植，尤以廣東、廣西、福建、浙江、云南等省最為廣泛，并逐漸傳入我國北方作一年生蔬菜栽培。果實(shí)有綠皮與白皮兩種品系，果肉白色，梨形，有5條縱溝，質(zhì)量200～300g。佛手瓜性喜溫暖、肥沃、濕潤與保水土壤，不耐澇，能耐高溫。佛手瓜生產(chǎn)旺盛，果實(shí)產(chǎn)量極高。單株覆蓋面積達(dá)60～80m2，每株年產(chǎn)果300～500個(gè)，畝產(chǎn)可達(dá)3000～4000kg。佛手瓜生長迅速、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富，但由于其口感一般，故其價(jià)格一直較低，限制了佛手瓜的推廣。對(duì)佛手瓜進(jìn)行深加工，延長產(chǎn)業(yè)鏈，增加附加值，是必由之途。近年來，針對(duì)佛手瓜深加工研究不斷。佛手瓜可開發(fā)成酸奶[1]、膳食纖維素[2]、果脯[3]、蔬菜酒[4]、果醬[5]及腌制品[6]等。

1866年，英國科學(xué)家Brown首次報(bào)道木醋桿菌可合成細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)[7]。后經(jīng)研究證實(shí)，除了醋酸桿菌屬外，能產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌種還包括根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬等[8]。細(xì)菌纖維素是葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接成的高分子聚合物[9]。細(xì)菌纖維素具有許多植物纖維素?zé)o可比擬的優(yōu)點(diǎn)，故具有廣泛的用途。例如，食品行業(yè)中用作加工椰果的原料[10]、造紙行業(yè)用于生產(chǎn)特種功能紙[11]、環(huán)保行業(yè)用作重金屬吸附材料[12-13]、生物醫(yī)學(xué)材料[14-15]、酶與細(xì)胞支撐材料[16]、化妝品中的保水材料等。目前，細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)主要以椰子汁為原料。眾所周知，椰子由于受種植區(qū)域的局限，其來源十分有限，原料成本相對(duì)較高。利用佛手瓜汁富含營養(yǎng)成分的特點(diǎn)，用作工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)高附加值的細(xì)菌纖維素，既是另一種佛手瓜深加工研究方向，也可拓寬細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的原料渠道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠皮佛手瓜，購自廣州市菜市場(chǎng)。

木醋桿菌(Acetobacter xylinus)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

酵母膏、細(xì)菌學(xué)蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、KH2PO4、檸檬酸、NaCl、蔗糖、硫酸銨(均為分析純) 廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 培養(yǎng)基

佛手瓜汁制備：新鮮佛手瓜用榨汁機(jī)粉碎，煮沸破壞葉綠素，然后過濾去除濾渣，收集濾液備用。種子培養(yǎng)基：葡萄糖2g/100mL、酵母膏0.5g/100mL、蛋白胨0.5g/100mL、KH2PO40.1g/100mL、檸檬酸0.1g/100mL、自然pH值、110℃滅菌30min；用作斜面時(shí)加瓊脂2g/100mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：新鮮制備的佛手瓜汁1L、蔗糖4g/100mL、硫酸銨0.3g/100mL、KH2PO40.1g/100mL、NaCl 0.2g/100mL、pH4.0～5.0，分裝組織培養(yǎng)瓶，每個(gè)100mL，121℃滅菌15min。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將經(jīng)斜面活化的木醋桿菌接種于液體種子培養(yǎng)基150r/min振蕩培養(yǎng)，于30℃培養(yǎng)16h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件

在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展過程中，土地發(fā)揮著巨大作用，工業(yè)發(fā)展或第三產(chǎn)業(yè)發(fā)展都離不開土地，對(duì)于很多農(nóng)民來說，土地使用權(quán)被交易意味著維持基本生存的方式喪失，在加重他們基本生活困境的同時(shí)，造成他們對(duì)國家的信任大幅度降低?；谶@種情況，國家開始對(duì)占用土地的農(nóng)民進(jìn)行經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償。隨著國家對(duì)農(nóng)民土地征收并給予經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償?shù)默F(xiàn)象增多，商家在發(fā)展經(jīng)濟(jì)的同時(shí)也著眼于對(duì)農(nóng)民土地的使用上，這種現(xiàn)象在經(jīng)濟(jì)誘導(dǎo)下日趨嚴(yán)重，大量農(nóng)民因此獲得一時(shí)的經(jīng)濟(jì)來源，隨著時(shí)間的推移，造成長久生存發(fā)展上的危機(jī)。針對(duì)此問題，國家應(yīng)加強(qiáng)控制，通過政策以及具體管理措施來改善。

接種量為體積分?jǐn)?shù)10%，30℃靜置培養(yǎng)8d，收集纖維素膜分析。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析

采用序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，將溫度、蔗糖質(zhì)量濃度、佛手瓜汁用量、pH值、硫酸銨質(zhì)量濃度、KH2PO4質(zhì)量濃度6個(gè)參數(shù)進(jìn)行分部析因設(shè)計(jì)，篩選對(duì)細(xì)菌纖維素有顯著影響的因素并初步考察各因素間的相互關(guān)系。利用爬坡設(shè)計(jì)尋找合適的試驗(yàn)空間。最后再利用中心組合設(shè)計(jì)來確定在試驗(yàn)空間內(nèi)的最大或最小響應(yīng)點(diǎn)(即相應(yīng)因素的最佳取值)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析主要應(yīng)用Minitab 15設(shè)計(jì)與SAS 9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件[17]。

1.3.4 纖維素干質(zhì)量測(cè)定

收集纖維素，置于80℃ 0.1mol/L NaOH溶液中維持2h，冷卻后用0.1mol/L HCl中和，自來水充分洗滌，80℃干燥至質(zhì)量恒定，稱量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分部析因設(shè)計(jì)

圍繞提高以佛瓜汁為主要培養(yǎng)基的纖維素發(fā)酵水平，選定溫度、蔗糖質(zhì)量濃度、佛手瓜汁用量、p H值、硫酸銨質(zhì)量濃度、KH2PO4質(zhì)量濃度6個(gè)參數(shù)進(jìn)行序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各參數(shù)的水平選擇見表1。

表1 分部析因設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Factors and levels in fractional factorial design (FFD)

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Protocol and results of Plackett-Burman design

回歸分析結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析Table 3 Regression analysis of Plackett-Burman design experimental results

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的回歸因子主效應(yīng)圖見圖1。

由表3和圖1可知，在6個(gè)因素中，X2(蔗糖質(zhì)量濃度)與X5(pH值)對(duì)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量影響最大(P＜0.05)。對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行曲率分析，顯示以上設(shè)計(jì)的試驗(yàn)空間為一曲面，但有P=0.081＞0.05，說明在該曲面內(nèi)不存在極值響應(yīng)點(diǎn)，需繼續(xù)搜索。圖1表明，在設(shè)定的空間內(nèi)溫度對(duì)纖維素的產(chǎn)量幾乎無影響；(NH4)2SO4和KH2PO4影響呈弱的負(fù)相關(guān)；佛手瓜汁用量呈弱的正相關(guān)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，在后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)過程確定溫度28℃、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度0.3g/100mL、佛手瓜汁用量100%。

圖1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的回歸因子主效應(yīng)圖Fig.1 Main effects plot of each regression factor in Plackett-Burman design

2.2 最速爬坡試驗(yàn)

表4 最速爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Protocol and results of steepest ascent design

由于細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量與蔗糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，故確定3g/100mL為原點(diǎn)；pH值與產(chǎn)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系，故確定pH6.0為原點(diǎn)，進(jìn)行最速爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，試驗(yàn)10#(X2=6.6，X5=4.2)得到細(xì)菌纖維素的最大產(chǎn)量4.81g/L。該點(diǎn)前，自試驗(yàn)1#～9#，產(chǎn)量逐漸上升；該點(diǎn)之后，自試驗(yàn)11#～12#產(chǎn)量逐漸下降。故選擇(X2=6.6，X5=4.2)作為中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)。

2.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)分部析因試驗(yàn)結(jié)果，蔗糖質(zhì)量濃度與pH值是影響細(xì)菌纖維素的顯著性因素，故選擇這兩個(gè)因素進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以尋找最優(yōu)工藝條件。根據(jù)最速爬坡試驗(yàn)結(jié)果，(X2=6.6，X5=4.2)得到的產(chǎn)量最高，故選擇此點(diǎn)為中心。考慮參數(shù)變化幅度對(duì)產(chǎn)量影響的顯著性程度，蔗糖應(yīng)選擇較大的空間，pH值可選擇相對(duì)較小的空間。綜合分部析因與最速爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選擇X2(6.0，7.2)、X5(4.0，4.4)為空間，進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Protocol and results of central composite design

響應(yīng)曲面分析表明，曲率P=0.001＜0.05，因此，在試驗(yàn)空間內(nèi)有極值響應(yīng)點(diǎn)，其曲面圖見圖2。

圖2 中心組合試驗(yàn)蔗糖質(zhì)量濃度與pH值對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Response surface plot indicating the effects of sugar concentration and pH on bacterial cellulose production

對(duì)圖2的曲面進(jìn)行回歸分析得到回歸模型為：

Y=1.96155X2＋13.7502X5－0.156597X22－1.65937X52＋0.0208333X2X5－30.3677

該回歸模型具有非常高的顯著性，其P=0.001＜0.01、R2=93.44%、R2Adj=88.75%，說明該模型能擬合本試驗(yàn)空間中93%的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)圖2中的響應(yīng)曲面進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化分析，可得到Y(jié)最大=4.8149g/L，其對(duì)應(yīng)的因素值分別為蔗糖質(zhì)量濃度(X2)為6.5400g/100mL、pH(X5)4.1857，在此條件下進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，均接近模型值，這證實(shí)了該模型的可靠性。

3 結(jié)論與討論

利用序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)木醋桿菌利用佛手瓜汁發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的工藝條件進(jìn)行探討。確定了較合適的發(fā)酵工藝條件：溫度28℃、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度0.3g/100mL、佛手瓜汁用量100%、蔗糖質(zhì)量濃度6.54g/100mL、pH4.19。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，木醋桿菌以佛手瓜汁為原料發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素干基產(chǎn)量最高可達(dá)4.81g/L。結(jié)果表明，統(tǒng)計(jì)分析方法在優(yōu)化及建立穩(wěn)定的發(fā)酵工藝條件等方面是一個(gè)很好的工具，具有十分重要的作用。對(duì)受多個(gè)因素影響的發(fā)酵工藝，先利用Plackett-Burman分部析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)各個(gè)影響因子對(duì)發(fā)酵的影響程度進(jìn)行評(píng)估，找出影響顯著的因子，然后利用最速爬坡試驗(yàn)找到顯著影響因子的中心點(diǎn)，以此進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，進(jìn)行曲面分析與回歸，可建立工藝模型，找到試驗(yàn)空間中的極大值點(diǎn)，為建立最佳工藝條件提供依據(jù)和指導(dǎo)。

[1] 王曉杰, 危睛, 李雙石, 等. 佛手瓜酸奶發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009(6): 330-332.

[2] 張巖, 張友勝, 吳繼軍, 等. 佛手瓜水溶性膳食纖維提取及應(yīng)用[J].山東食品發(fā)酵, 2008(3): 29-31.

[3] 徐莉珍, 吳婷婷, 揚(yáng)啟財(cái), 等. 佛手瓜果脯真空滲糖加工工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2009(3): 138-141.

[4] 許曉春, 林朝朋. 佛手瓜蔬菜酒發(fā)酵工藝研究[J]. 中國釀造, 2008(3):96-98.

[5] 丁利君. 佛手涼果和果醬的研制[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2005(2): 51-53.

[6] 丁利君, 陳艷, 李敏瑛. 超聲波對(duì)佛手瓜果膠提取效果的影響[J]. 廣州食品工業(yè)科技, 2004, 20(2): 51-52.

[7] BROWN A J. On an acetic ferment which forms cellulose[J]. Journal of the Chemical Society, 1866, 49: 172-186.

[8] 馬霞, 王瑞明, 關(guān)鳳梅, 等. 發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株的特點(diǎn)[J]. 四川食品與發(fā)酵, 2005, 41(1): 20-22.

[9] YAMANAKA S, WATANABE K, KITAMURA N, et al. The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose[J].Journal of Materials Science, 1989, 24(9): 3141-3145.

[10] JAGANNATH A, KALAISELVAN A, MANJUNATHA S S, et al. The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) byAcetobacter xylinum[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(11):2593-2599.

[11] BASTA A H, EI-SAID H. Performance of improved bacterial cellulose application in the production of functional paper[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 107(6): 2098-2107.

[12] CHEN Shiyan, ZOU Yu, YAN Zhiyong, et al. Carboxymethylatedbacterial cellulose for copper and lead ion removal[J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 161(2/3): 1355-1359.

[13] OSHIMA T, KONDO K, OHTO K, et al. Preparation of phosphorylated bacterial cellulose as an adsorbent for metal ions[J]. Reactive and Functional Polymers, 2008, 68(1): 376-383.

[14] GRANDE C J, TORRES F G, GERMOZ C M, et al. Nanocomposites of bacterial cellulose/hydroxyapatite for biomedical applications[J]. Acta Biomaterialia, 2009, 5(5): 1605-1615.

[15] MILLON L E, GUHADOS G, WAN W. Anisotropic polyvinyl alcoholbacterial cellulose nancomposite for biomedical application[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2008,86(2): 444-452.

[16] WU Shengchi, LIA Yingke. Application of bacterial cellulose pellets in enzyme immobilization[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2008, 64(3/4): 103-108.

[17] RAMIREZ J, GUTIERREZ H, GSCHAEDLER A. Optimization of astaxanthin production byPhaffia rhodozymathrough facterial design and response surface metholology[J]. Journal of Biotechnology, 2001,88(3): 259-268.

Sequential Design Optimization of Bacterial Cellulose Production byAcetobacter xylinusUsing Chayote(Sechium edule) Juice as the Basal Fermentation Medium

LI Jia-zhou，XIAO Yu-ping，HUANG Rong-lin，ZHAO Xin
(Department of Food and Bioengineering, Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China)

Chayote (Sechium edule) Juice was used as the basal fermentation medium to prepare bacterial cellulose through the fermentation ofAcetobacter xylinus. Plackett-Burman factorial design was used to determine the effects of sugar concentration and pH on productivity of bacterial cellulose. Steepest ascent method was used to determine the central point of both factors. Central composite design was used to build the experimental model and the optimal processing conditions were fermentation temperature of 28 ℃, (NH4)2SO4 concentration of 0.3 g/100 mL,Schehium edulejuice concentration of 100 %, sugar concentration of 6.54 g/100 mL and pH 4.19. Under the optimal processing conditions, the yield of bacterial cellulose was up to 4.18 g/L (dry weight).

Schehium edulejuice；bacterial cellulose；sequential design

TS255.36

A

1002-6630(2011)06-0095-04

2010-06-04

廣東省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2005B20401011)

李家洲(1976—)，男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵工藝。E-mail：lijiaou@gdqy.edu.cn