新疆紫草中萘醌類成分的提取工藝研究

馮文文,李國(guó)玉,譚勇,王航宇,王金輝,2

(1石河子大學(xué)藥學(xué)院/教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002;2沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院,沈陽(yáng)110016)

新疆紫草中萘醌類成分的提取工藝研究

馮文文1,李國(guó)玉1,譚勇1,王航宇1,王金輝1,2

(1石河子大學(xué)藥學(xué)院/教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002;2沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院,沈陽(yáng)110016)

為了確定新疆紫草中萘醌類成分的最佳提取工藝,本研究以新疆紫草中主要萘醌類成分的含量為指標(biāo),利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定其含量,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取工藝全面優(yōu)選。結(jié)果顯示,最佳提取工藝為:新疆紫草粗粉,用12倍量95%乙醇冷浸8 h。采用冷浸法提取新疆紫草中萘醌類成分,操作簡(jiǎn)便,方法可行,降低了生產(chǎn)成本,提高了藥材利用率,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

新疆紫草;萘醌;正交設(shè)計(jì)法;高效液相色譜

紫草(Radix A rnebiae,Radix L ithospermi)為紫草科植物新疆紫草 A rnebia euchroma(Royle)Johnst、紫草 L ithospermum erythrorhizonSieb.et Zucc.或內(nèi)蒙紫草 A rnebia guttataBunge的干燥根 ,其味甘、咸 ,性寒 ,歸心 、肝經(jīng) ,有涼血 、活血 、解毒透疹的功效[1]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明紫草具有抗腫瘤[2-3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、保肝護(hù)肝[6]等多種藥理活性,萘醌類成分為其主要的活性成分,故其含量高低必定影響藥品質(zhì)量。紫草萘醌類成分極性較小,易溶于石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑和植物油。王陽(yáng)等[7]采用麻油作為提取溶劑,用均勻設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化紫草素的提取工藝,結(jié)果表明130～135℃提取13～39 min為最佳提取工藝。油炸法雖然安全性較高,但萘醌類化合物在溫度大于80℃時(shí)穩(wěn)定性急劇下降,容易遭到破壞[8],所以萘醌類成分提取時(shí)控制溫度很重要,冷浸法、滲漉法[9]等提取方法的應(yīng)用可以保證紫草色素的穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)以新疆紫草中9種主要萘醌類成分為指標(biāo),比較了不同濃度乙醇和超聲法、冷浸法、滲漉法3種提取方法對(duì)紫草萘醌類成分的提取效果,并采用正交設(shè)計(jì)法考察、建立了冷浸法提取萘醌成分的最佳工藝,可為新疆紫草的深度開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆紫草2007年采自新疆天山,經(jīng)生藥學(xué)鑒定為新疆紫草(A rnebia euchroma(Royle)Johnst)的根 ,粉碎后過(guò)篩備用。萘醌對(duì)照品(1、2、3、4、5、6、7、8、9)均為本實(shí)驗(yàn)室自制 ,經(jīng) UV、HR-MS、NMR鑒定,HPLC測(cè)定純度均在99%以上。液相用乙腈、甲醇均為色譜純,購(gòu)自J.T.Baker Co.Ltd(USA),乙醇為95%醫(yī)用乙醇,水為重蒸水,其余試劑為分析純。

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);SK5200HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限責(zé)任公司);AR1140電子分析天平Sartorius(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 新疆紫草萘醌類成分含量測(cè)定方法的建立

新疆紫草中萘醌類成分在波長(zhǎng)274 nm、517 nm處均有著較強(qiáng)的紫外吸收,且無(wú)干擾,在進(jìn)行提取工藝考察時(shí),利用RP-HPLC法測(cè)定新疆紫草提取液中萘醌類成分的含量[10],對(duì)新疆紫草中萘醌類成分的提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.1.1 干膏量測(cè)定

參照2005年版《中國(guó)藥典》附錄XA浸出物測(cè)定法,精密量取相當(dāng)于新疆紫草3 g的藥液,置于已干燥恒重的蒸發(fā)皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3 h,移于干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量,計(jì)算干膏重量。

1.2.1.2 藥材中萘醌的含量測(cè)定

色譜條件:色譜柱為 Scienhome Kromasil C18(4.6 mm×200 mm,5μm)及預(yù)柱,流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%磷酸水(B),梯度洗脫過(guò)程(A梯度)0～10 min 70%,10～30 min 70%～75%,30～31 min 75%～95%,31～36 min 95%,36～37 min 95%～70%,37～50 min 70%。檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm,柱溫30℃,流速1.0 mL/min,理論板數(shù)萘醌計(jì)不低于3000。

藥材的測(cè)定:取新疆紫草粗粉約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,搖勻,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,用微孔濾膜(0.22μm)濾過(guò),按前述色譜條件進(jìn)樣10μL分析。

1.2.1.3 樣品中萘醌的含量測(cè)定

將新疆紫草提取液過(guò)濾,定容后精密量取濾液1 mL用甲醇定容至10 mL容量瓶中,微孔濾膜過(guò)濾,取濾液,按1.2.1.2色譜條件,進(jìn)樣 10μL,計(jì)算其中九種萘醌總含量、質(zhì)量分?jǐn)?shù),然后按下式計(jì)算萘醌的收率。

1.2.2 萘醌類成分提取工藝研究

1.2.2.1 提取溶劑的考察

根據(jù)萘醌類成分的理化性質(zhì),結(jié)合臨床常規(guī)應(yīng)用方法,本文考察了95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇對(duì)萘醌成分的提取效果。精密稱取新疆紫草粗粉1.0 g,加入100 mL提取溶劑,超聲處理30 min,提取液過(guò)濾,取濾液,按1.2.1.2項(xiàng)下色譜條件,測(cè)定提取液中萘醌的含量,并計(jì)算萘醌收率。

1.2.2.2 提取方法的比較

根據(jù)萘醌類成分對(duì)熱不穩(wěn)定的性質(zhì),本文沒(méi)有采用回流提取、索式提取等熱提取方法,而是對(duì)超聲法、冷浸法(室溫20℃)和滲漉法等冷提方法提取萘醌類成分的效果進(jìn)行了比較。精密稱取5.0 g新疆紫草粗粉以15倍量95%乙醇提取,比較不同提取方法對(duì)萘醌收率的影響,平行操作3份,計(jì)算萘醌平均收率。

1.2.2.3 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選萘醌類成分的最佳提取工藝

在萘醌類成分的提取工藝研究過(guò)程中,擬對(duì)乙醇濃度、乙醇用量以及提取時(shí)間的不同水平進(jìn)行考察,以便尋找出最佳提取工藝參數(shù)。具體因素水平的設(shè)計(jì)詳見表1。

精確稱量新疆紫草粗粉5.0 g,按L9(34)設(shè)定具體工作安排表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定并計(jì)算萘醌收率,結(jié)果用極差法及方差法進(jìn)行分析。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平Tab.1 Factors and level in the cold-infuse extraction

1.2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用以上確定的最佳條件進(jìn)行三批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),即以10.0 g新疆紫草藥材,按最佳提取工藝進(jìn)行提取,測(cè)定并計(jì)算萘醌平均收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆紫草萘醌類成分的含量測(cè)定方法

結(jié)果顯示新疆紫草藥材中9種萘醌化合物含量之和為6.264 mg/100mg。

萘醌對(duì)照品 HPLC色譜圖見圖1,2。

按1.2.1.2中色譜條件對(duì)新疆紫草進(jìn)行分析,

圖1 萘醌對(duì)照品HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards

圖2 新疆紫草供試品HPLC色譜 Fig.2 HPLC chromatograms of Radix Arnebiae

2.2 萘醌類成分提取工藝研究

2.2.1 提取溶劑的考察

95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇超聲提取 30 min,萘醌收率分別為 99.80%、97.56%、33.09%。由此可知95%乙醇對(duì)紫草萘醌提取效率最高,70%乙醇的提取效率次之,50%乙醇對(duì)萘醌的提取率急劇下降。

2.2.2 提取方法的比較

各提取方法萘醌類成分收率如表2所示:滲漉法＞冷浸法＞超聲法。

表2 不同提取方法提取萘醌類成分效果的比較Tab.2 Comparation of results of different extraction methods in naphthaquinones extracting

冷浸法是常用的提取方法之一,新疆紫草中萘醌類成分對(duì)光、熱不穩(wěn)定,冷浸提取有利于保護(hù)萘醌成分的穩(wěn)定性。

由表2結(jié)果可知,本實(shí)驗(yàn)采用的3種提取方法對(duì)萘醌類收率均大于90%,且差別不大。超聲提取與冷浸提取相比,雖提取時(shí)間短,但收率略低,有文獻(xiàn)報(bào)道超聲大于半小時(shí)對(duì)新疆紫草中萘醌成分會(huì)有影響,且超聲提取對(duì)設(shè)備要求高,能耗大;冷浸法收率雖然稍低于滲漉法,但綜合比較來(lái)看,冷浸法作為提取萘醌類成分初始提取方法,可以節(jié)約能源,而且對(duì)設(shè)備要求低,操作簡(jiǎn)便,轉(zhuǎn)移率高,更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2.3 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選萘醌類成分最佳提取工藝

按L9(34)設(shè)定具體工作安排表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),考察冷浸法提取紫草萘醌類類成分的最佳工藝參數(shù),具體結(jié)果見表3、表4。

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排及直觀分析結(jié)果Tab.3 The design and results of the orthogonal test

表4 正交設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果Tab.4 Variance analyzed in the orthogonal test

根據(jù)極差R的大小,其影響因素順序?yàn)锳＞C＞B,即乙醇濃度＞提取時(shí)間＞乙醇用量。由直觀分析可知最佳工藝為A1B2C2,即乙醇濃度為95%、乙醇用量為12倍、提取時(shí)間16 h。

根據(jù)對(duì)方差和極差的綜合分析可以發(fā)現(xiàn),乙醇濃度是新疆紫草冷浸工藝的最主要影響因素,故95%為最佳冷浸濃度;提取時(shí)間為次要影響因素,8 h與16 h提取量相差較小,從節(jié)約時(shí)間方面考慮,采取冷浸提取8 h;本實(shí)驗(yàn)考察的乙醇用量對(duì)萘醌收率的影響最小,通過(guò)直觀分析,優(yōu)選12倍量乙醇。綜上所述,我們篩選的冷浸法最佳工藝為A1B2C1,即:藥材粗粉,12倍量95%乙醇溶液,冷浸8 h后,過(guò)濾并收集冷浸液即得。由于A因素已經(jīng)是95%乙醇,大生產(chǎn)上無(wú)法使用更高濃度的乙醇,故關(guān)于此因素的追加試驗(yàn)舍去。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用以上確定的最佳條件進(jìn)行三批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),即以10.0 g新疆紫草藥材,按最佳條件冷浸提取,過(guò)濾并收集冷浸液,測(cè)定結(jié)果見表5,其中萘醌平均收率為86.8%,重復(fù)試驗(yàn) RSD值小于2%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)中的最佳工藝相比相差較小,故從時(shí)間、能源各方面綜合考慮,認(rèn)為 A1B2C1(藥材粗粉,12倍量95%乙醇溶液,冷浸8 h后,過(guò)濾并收集冷浸液)為紫草萘醌冷浸提取法最佳工藝。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Tab.5 Varifying test in the cold-infuse extraction

3 結(jié)論

直觀分析和方差分析結(jié)果表明各因素對(duì)萘醌類成分冷浸提取的影響大小依次為乙醇濃度＞提取時(shí)間＞乙醇用量。其中乙醇濃度對(duì)萘醌收率有顯著影響,其他因素?zé)o顯著影響。根據(jù)縮短生產(chǎn)周期,降低生產(chǎn)成本的原則,得出新疆紫草萘醌成分冷浸法提取的最佳工藝為:藥材粗粉,采用12倍量95%乙醇冷浸8 h,過(guò)濾并收集冷浸液即得。按最佳工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果表明該最佳提取工藝具有良好的重現(xiàn)性。

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Extraction Process of Naphthaquinones inRadix Arnebiae

FENG Wenwen1,LI Guoyu1,TAN Yong1,WANG Hangyu1,WANGJin-hui1,2
(1 School of Pharmacy,Shihezi University/Key Laboratory of Phytomedicine Resources&Modernization of TCM,Shihezi 832002,China;2 School of Traditional Chinese Materica Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China)

To study the best extraction method of naphthaquinones in Radix Arnebiae.The extraction process was studied by orthogonal design with the contents of naphthaquinones determined by RP-HPLC as index.The best method of extraction is coldsoaking with 12 times 95%alcohol for 8 hours.The extraction method for Radix Arnebiae can save energy and be suitable for the modern production.

Radix A rnebiae;Naphthaquinones;Orthogonal design;HPLC

R28 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

A

2010-05-26

馮文文(1983-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞值难芯俊?/p>

王金輝(1972-),男,教授,從事天然藥物化學(xué)研究;e-mail:wjh.1972@yahoo.com.cn。