金龍飛,沈月松,吳勇飛,吳臘梅

(中南民族大學化學與材料科學學院,武漢430074)

L-谷氨酸-5-甲酯金屬化合物的合成、表征和生物活性

金龍飛,沈月松,吳勇飛,吳臘梅

(中南民族大學化學與材料科學學院,武漢430074)

在仿自然的條件下,合成了L-谷氨酸-5-甲酯.對L-谷氨酸-5-甲酯晶體進行了X-射線單晶衍射測定.測量表明,L-谷氨酸-5-甲酯屬單斜晶系,C2空間群,其中a=10.286(3)?,b=4.6163(11)?,c=17.111(4)?;β=104.995(4)°.通過L-谷氨酸-5-甲酯與M gCl2·6H2O 和Ca(OH)2反應,分別合成得到了相應的金屬化合物.用比色法測試了L-谷氨酸-5-甲酯對三磷酸腺苷二鈉分解的催化活性,結果表明:L-谷氨酸-5-甲酯合鎂和L-谷氨酸-5-甲酯合鈣對三磷酸腺苷二鈉的分解具有較好的活性.

L-谷氨酸衍生物;生物活性;三磷酸腺苷二鈉

三磷酸腺苷既是一種重要的輔酶,又是體內(nèi)能量的主要來源.由于谷氨酸殘基是三磷酸腺苷分解酶和輔酶的結構特征之一,因此對谷氨酸的修飾以及配合物的研究,將有可能尋找到影響三磷酸腺苷活性的化合物或配合物.近20多年,氨基酸類產(chǎn)品應用大為廣泛[1],其中對L-谷氨酸及其衍生物的研究則是熱點方向之一[2,3],目前國內(nèi)外相關研究報道層出不窮[4].通過擴展谷氨酸衍生物的修飾及其配合物的合成以研究對三磷酸腺苷分解的催化活性的研究,發(fā)現(xiàn)功能與結構的關系,為合成具有三磷酸腺苷分解酶和輔酶活性的模擬化合物提供指導作用,并有望合成活性更高的三磷酸腺苷分解酶和輔酶的模型化合物.由于三磷酸腺苷分解酶的結構及其催化機理極其復雜,所以設計高效專一的三磷酸腺苷分解酶模型化合物,具有重大的理論及實際意義.本論文基于自然溫和條件,選擇L-谷氨酸為原料合成L-谷氨酸-5-甲酯及其金屬化合物,并擬測試其對三磷酸腺苷分解的生物活性,為進一步研究具有三磷酸腺苷分解酶和輔酶活性的模擬化合物打下較好基礎.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Perkin Elmer 2400 CHN型元素分析儀;FT-IR N EXU S智能型高分辨傅立葉紅外光譜儀(KBr壓片);UV-265可見紫外分光光度計(25℃,190～700 nm);X-4數(shù)字熔點儀.

L-谷氨酸、三羥基氨基甲烷、三磷酸腺苷二鈉為生物試劑;其它試劑均為分析純,未進一步提純.

1.2 實驗方法

1.2.1L-谷氨酸-5-甲酯的合成

L-谷氨酸-5-甲酯參照文獻[5]法合成.取L-谷氨酸7.50 g(0.05 mol)置于燒瓶中,加入無水甲醇120 mL,邊攪拌邊加入3.70 mL 98% 濃H2SO4于25℃反應4～5 h.用三乙胺的甲醇溶液(V醇∶V胺=2∶1)調節(jié)至pH=8.0,置于冰箱中過夜.次日抽濾出固體,用95%甲醇進行重結晶,用無水甲醇洗滌.常溫下真空干燥至恒重,純品為白色晶狀固體.產(chǎn)率93.8%.mp:169～ 170℃.A nal.,Found:C,45.02;H,6.89;N,8.71%.Calc:(C6H11NO4):C,44.72;H,6.88;N,8.69%.FT-IR(KBr pellet,ν/cm-1):3130～2598 m,1730 s,1611 s,1583 s,1355 m,2752～2 250 w,1080 m.將合成的L-谷氨酸-5-甲酯固體用50%的甲醇水溶液溶解后于室溫下放置使溶劑慢慢揮發(fā),7 d后溶液中析出可供測量的無色晶體.

1.2.2L-谷氨酸-5-甲酯合鎂的合成

將0.32 g(2.00 mmol)L-谷氨酸-5-甲酯溶于15 mL水中,在室溫下攪拌使其完全溶解,緩慢滴加5mL溶有0.21 g(1.05mmol)M gCl2·6H2O的水溶液,用0.10 mol/L N a2CO3溶液緩慢調節(jié)溶液至pH=6.0～7.0,溶液為無色.繼續(xù)反應30 m in,反應完畢后減壓蒸餾溶液至粘稠狀,加入無水甲醇10～ 15 mL,溶液中出現(xiàn)白色沉淀物.過濾,用無水甲醇洗滌,干燥.產(chǎn)率:87.1%.mp＞300℃.A nal.,Found:C,42.02;H,5.82;N,8.21%.Calc:(C12H20 M gN2O8):C,41.82;H,5.85;N,8.13%.FT-IR(KBr pellet,ν/cm-1):1727 s,1621 s,1566 s,1321 m,1053 m,568 m,482 m.

1.2.3L-谷氨酸-5-甲酯合鈣的合成

將0.32 g(2.00mmol)L-谷氨酸-5-甲酯溶于15 mL水中,室溫下攪拌使其完全溶解.用Ca(OH)2的水溶液緩慢調節(jié)至pH=7.0,溶液為無色.繼續(xù)反應30m in,反應完畢后減壓蒸餾溶液至粘稠狀,加入無水甲醇10～15 mL,溶液中出現(xiàn)白色沉淀物.過濾,用無水甲醇洗滌,干燥.產(chǎn)率:72.1%.mp＞300℃.A nal.,Found:C,39.95;H,5.63;N,7.83%.Calc:(C12H20CaN2O8):C,39.99;H,5.59;N,7.77%.F I-IR(KBr pellet,ν/cm-1):1724 s,1617 s,1569 s,1336 m,1041 m,576 m,485 m.

1.2.4L-谷氨酸-5-甲酯晶體結構的測定

取0.30 mm×0.30 mm×0.06 mm無色晶體置于Bruker SMART A PEX CCD X-射線單晶衍射儀上,在293(2)K,采用石墨單色化的M oKa射線 (λ=0.71073?)作為衍射光源,掃描方式為Φ和ω,于2.46≤θ≤28.16收集得1287個衍射點,其中953個是獨立點,R int值為0.0506.所有數(shù)據(jù)均采用SADABS multi-scan校正程序進行校正[6,7],其中,對滿足I＞2σ(I)的953個點進行結構解析.用直接法解得晶體結構.對所有非氫原子坐標,使用全距陣最小二乘法進行各項異性溫度因子修正[7-9].對與N和C原子鍵合的H原子,采用騎跨式理論加氫,其中鍵長分別為0.89(NH3—H 原子)、0.98(CH—H 原子)和0.97?(CH2—H 原子 ),Ueq(H)為1.2Ueq(母體原子)(—CH3和—NH3中H 原子,為1.5Ueq).最后精修結果為R1= 0.0506,w R2=0.1598(見表1).

1.2.5 催化三磷酸腺苷二鈉分解的活性測試

催化三磷酸腺苷二鈉分解的效果(活力大小)可用反應終止后反應液中無機磷(Pi)含量衡量[10-12].而無機磷可與硫酸鉬酸銨反應生成有色化合物,因此無機磷含量可用比色法測定.

無機磷標準曲線的繪制:在均加有0.1 mL 20% 三氯酸(TCA)、0.3 mL H2O 的7支編號試管中分別加入0.1mL 的0、10、20、30、40、50、60mmol/L的N a2HPO3,再于各試管中加入2.5 mL硫酸鉬酸銨-硫酸亞鐵溶液,搖勻并于波長660 nm處測定吸收值OD.測量5次/樣品.以測定的OD值為縱坐標,Pi濃度為橫坐標作圖,即得無機磷標準曲線.

化合物對三磷酸腺苷二鈉分解活性的測定則通過測定混合體系的OD值后,比較無機磷標準曲線得相應的無機磷含量,即可判斷出活性影響.具體操作:分別取反應介質0.4 mL于2支試管中,一支試管中依次加入0.4 mL化合物的溶液和1.0 mL溶劑,另支試管中直接加入1.4 mL溶劑(作為參照液).于室溫下反應5 m in后于2支試管中分別加入0.2 mL 20%TCA中止反應.吸取上述反應液各0.5 mL,各加入2.5 mL硫酸鉬酸銨-硫酸亞鐵溶液.以參照液為對照并于660 nm處測定化合物溶液在的OD值.其中,反應溶液分別按下比例配制:

① 介質溶液:50 mmol/L三羥基氨基甲烷(T ris)-HCl(pH=8.80)+5 mmol/L三磷酸腺苷二鈉+20 mmol/L N aCl+100 mmol/L CH3OH;

②10% 質量分數(shù)的硫酸鉬酸銨溶液:10 g鉬酸銨+100 mL 5 mol/L硫酸;

③硫酸鉬酸銨-硫酸亞鐵溶液:5 g硫酸亞鐵+10 mL 10%硫酸鉬酸銨溶液+87.5 mL蒸餾水;

④待測目標化合物溶液配制:將待測目標化合物配成質量濃度約16 g/L溶液.

表1 晶體學數(shù)據(jù)Tab.1 Crystallographic data

2 結果與討論

2.1 合成和結構的光譜分析

L-谷氨酸-5-甲酯的合成采用了仿自然條件,產(chǎn)率達到93.8%;所得L-谷氨酸-5-甲酯易溶于水,難溶于甲醇、乙醇、乙醚、DM F、DM SO 等有機溶劑;1.0 mmol/L水溶液其pH≈4.元素分析的測量結果與理論計算結果基本相符.

在L-谷氨酸-5-甲酯紅外光譜中,最顯著特點為1730 cm-1處呈現(xiàn)一個新的強吸收峰,可指定為酯基中 νas(C=O)特征吸收峰[13].3130～ 2958 cm-1為 νas(NH+3)吸收峰,2752～ 2250 cm-1為 νs(NH+3)吸收峰,1611 cm-1為 νas(COO-)吸收峰,1355 cm-1為 νs(COO-)吸收峰,1080 cm-1為ν(C—N)吸收峰,1583 cm-1為 δas(NH+3)吸收峰,1412 cm-1為 δs(NH+3)吸收峰.上述吸收峰較之反應物L-谷氨酸的標準紅外譜圖,其變化不大,說明在生成物分子中形成內(nèi)絡鹽部分的羧基和氨基依舊存在.

在鈣和鎂化合物的紅外光譜中,1600 cm-1處均有 νas(COO-)吸收峰,1350 cm-1為 νs(COO-)吸收峰;與L-谷氨酸-5-甲酯中νas(COO-)、νs(COO-)譜峰相比,均發(fā)生了移動,表明羧基與金屬離子的成鍵. 其中,Δν(COO-)≈250 cm-1,因此可認為化合物中羧基是以單齒配位模式與金屬離子成鍵的[14-16].1040 cm-1處有ν(C—N)伸縮振動,與L-谷氨酸-5-甲酯中ν(C—N)伸縮振動約差40 cm-1;同時未見νas(NH+3)、νs(NH+3)、δas(NH+3)及δs(NH+3)吸收峰,說明氨基中氮原子也參加了成鍵.此外,可認為560 cm-1和465 cm-1處的吸收峰分別為ν(N—M)和ν(O—M)伸縮振動[17-18].推測化合物的結構見圖1.元素分析數(shù)據(jù)也證明了該結構的可能性.

圖1L-谷氨酸-5-甲酯金屬化合物的可能結構Fig.1 Structures of metal complexes w ith 5-methyl-L-glutamate

2.2 晶體結構分析

L-谷氨酸-5-甲酯晶體屬單斜晶系、C2空間群,a= 10.286(3)?,b= 4.6163(11)?,c=17.111(4) ? ;β=104.995(4)°.其獨立單元結構見圖2.其晶體結構中化合物分子以內(nèi)鹽形式存在,其鍵長、鍵角均在正常范圍內(nèi)(見表2).其扭轉角Ψ1(N 1—C2—C1—O 2)=-34.1(3) °,Ψ2(N 1—C2—C1—O 2)=149.1(4) °,χ1(N 1—C2—C3—C4)=-56.2(4) °,χ2(C2—C3—C4—C5)=173.5(3) °,較之L-谷氨酸(Ψ1=-35 °, Ψ2=145 °, χ1= ±60 °,χ2=180°),有所改變.晶胞堆積見圖3.在晶體結構中,分子間存在N—H…O氫鍵作用(見表3).化合物沿ob方向堆積,每6個分子通過8個N—H…O 或O…H—N 構成一個聚合單元.

圖2L-谷氨酸-5-甲酯結構Fig.2 Structure of 5-methyl-L-glutamate

表2 選擇的部分鍵長、鍵角和扭角Tab.2 Selected bond lengths,bond angle and torsion angles

圖3 晶胞堆積圖Fig.3 Packing diagram in a unit cell

表3 氫鍵的鍵長和鍵角Tab.3 Hydrogen bond lengths and bond angles

2.3 對三磷酸腺苷二鈉分解的影響

測定所得化合物體系的磷含量見表4.

L-谷氨酸-5-甲酯組成體系所測的分解無機磷含量為-1.507mmol.由于實驗儀器及人為因素等可能產(chǎn)生的誤差(如:若OD讀數(shù)值誤差±0.001,則經(jīng)數(shù)據(jù)處理后對應的Pi含量誤差為±1.012),則可認為經(jīng)數(shù)據(jù)處理后對應的Pi含量存在誤差±1.507.因此,室溫下,可認定L-谷氨酸-5-甲酯對三磷酸腺苷二鈉活性無影響.

由表4可知,L-谷氨酸-5-甲酯合鎂和L-谷氨酸-5-甲酯合鈣對三磷酸腺苷二鈉的分解均有較好的活性,其活性L-谷氨酸-5-甲酯合鎂＞L-谷氨酸-5-甲酯合鈣.

表4 化合物體系的磷含量Tab.4 Contents of phosphorus of system s w ith complexes

3 結語

以L-谷氨酸為原料,采用仿自然的條件,在甲醇溶劑中,加入硫酸為催化劑,合成得到L-谷氨酸-5-甲酯.測試表明,L-谷氨酸-5-甲酯分子中的羧基和氨基依舊保留著內(nèi)絡鹽結構.L-谷氨酸-5-甲酯X-射線單晶衍射測定表明,L-谷氨酸-5-甲酯屬單斜晶系C2空間群,其中a=10.286(3)?,b=4.6163(11)?,c= 17.111(4)?;β= 104.995(4)°.L-谷氨酸-5-甲酯分別與M gCl2·6H2O 和Ca(OH)2反應,可合成得到相應的金屬化合物.對合成所得的化合物,進行了三磷酸腺苷二鈉分解的催化活性試驗.比色法測試實驗表明,在室溫(25°C)和pH=8.80條件下,L-谷氨酸-5-甲酯對三磷酸腺苷二鈉的分解幾乎無影響;而L-谷氨酸-5-甲酯合鎂和L-谷氨酸-5-甲酯合鈣對三磷酸腺苷二鈉的分解均產(chǎn)生較好的活性.

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Synthesis,Characterization and Biological Activity of M etal Complexes with 5-M ethyl-L-Glutamate

J in L ongf ei,S hen Yuesong,W u Yongf ei,W u L am ei
(College of Chem istry andM aterials Science,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

U nder im itated natural conditionsin the im itation, 5-methyl-L-glutamate was prepared and characterized by elemental analysis and IR. The crystal structure was determ ined by single-crystal X-ray diffraction.The crystal is of monoclinic type,space groupC2 w itha=10.286(3)?,b=4.6163(11)?,c=17.111(4) ? , β= 104.995(4)°.Two complexes of Ca(Ⅱ )and M g(Ⅱ )w ith 5-methyl-L-glutamate were obtained by reating 5-methyl-L-glutamate w ithM gCl2·6H2O and Ca(OH)2,respectively.Spectrophotometrywas used to test for their activities on the hydrolysis of adenosine disodium triphosphate.The results show that the complexes of Ca(Ⅱ )andM g(Ⅱ )had good activity.

derivants ofL-glutam ic acid;biological activity;adenosine disodium triphosphate

O 723:Q 599

A

1672-4321(2011)01-0017-04

2010-12-13

金龍飛(1962-),男,博士,研究方向:化學生物學與藥物化學;E-mail:longfei.jin@yahoo.com

湖北省自然科學基金重點資助項目(2008CDA 067)