20種多孔類真菌乙醇提取物體外抗氧化和抗腫瘤活性的比較研究

陳永強，陳先暉，孫 勇，繆 倩，王 力，蔣繼宏*

(徐州師范大學 江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

20種多孔類真菌乙醇提取物體外抗氧化和抗腫瘤活性的比較研究

陳永強，陳先暉，孫 勇，繆 倩，王 力，蔣繼宏*

(徐州師范大學 江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

采用清除DPPH自由基的方法和Alamar Blue法比較20種多孔類真菌乙醇提取物抗氧化活性和對3株癌細胞體外增殖的影響，對它們的子實體和菌絲體乙醇提取物進行測定。結果表明：20種多孔菌子實體乙醇提取物清除自由基和抗腫瘤活性大部分都強于菌絲體乙醇提取物，其中有10株多孔類真菌子實體乙醇提取物質量濃度在5mg/mL時，自由基清除率超過70%；質量濃度在500μg/mL時，對人非小肺癌細胞NCI-H460和人肝癌細胞HepG2兩株癌細胞抑制率在90%左右，而對耐藥細胞株Bel-7402/5-Fu抑制率略低于正常細胞株。

多孔菌；抗氧化；DPPH自由基；抗腫瘤活性

多孔菌目真菌是擔子菌中的一大類群，在我國的菌類藥物中許多屬于這一類真菌，如有名的傳統(tǒng)中藥豬苓、靈芝、茯苓等[1]。目前我國已知的多孔菌有11300余種，已知的藥用多孔菌有60余種，而有關報道的具有抗氧化和抗腫瘤活性的多孔類真菌也較多，如灰樹花、靈芝、云芝、樺褐孔菌以及俗稱“桑黃”的一大類多孔菌等[2-4]。近年來，一些研究人員以大型真菌為材料，對其提取物的抗氧化和抗腫瘤活性進行了研究，并且從其中一些真菌中分離出了一些具有較好抗氧化、抗腫瘤作用的化合物，這表明真菌是尋找抗氧化物質的理想材料[5-6]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，活性自由基是危害人體健康的重要因素之一。如果人體內自由基的數(shù)量過多，會導致脂質過氧化作用，蛋白質和DNA的損傷等造成組織、細胞的損傷，從而誘發(fā)衰老或多種疾病，如癌癥、心血管病、免疫系統(tǒng)功能下降和腦功能紊亂等疾病[7]。癌癥也是嚴重威脅人類生命健康的重要疾病之一，尋找更為有效及新的抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物具有重要的意義。近年來從食藥用真菌子實體中尋找毒副作用小、作用獨特、安全的天然活性物質，成為新藥開發(fā)的有效途徑之一。因此天然抗自由基損傷、抗腫瘤活性物質研究引起了病理、藥理和臨床工作者的廣泛重視[8]。

本研究以20種野生多孔類真菌子實體與菌種為材料，采用清除DPPH自由基的方法和Alamar Blue法對其乙醇提取物進行體外抗氧化和抗腫瘤活性檢測，為進一步開發(fā)抗氧化、抗腫瘤的多孔類真菌保健品及其藥品提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

20種野生多孔類真菌子實體與菌種：1.樺剝管孔菌(Piptoporus betulinus)；2.絨毛栓菌(Trametes pubescens)；3.芳香皺皮孔菌(Ischnoderma benzoinum)；4.白皮殼靈芝(Ganodema leucophacum)；5.白迷孔菌(Daedalea albida)；6.鈸孔菌(Coltricia perennis)；7.島生異擔子菌(Heterobasidion insulare)；8.毛栓菌(Trametes hirsuta)；9.榆生擬層孔菌(Fomitopsis ulmaria)；10.肉色擬迷孔菌(Daedalea dickinii)；11.紅肉擬層孔菌(Fomitopsis rosea)；12.哈爾蒂木層孔菌(Phellinus hartigii)；13.樺褶孔菌(Lenzites betulina)；14.灰白栓菌(Trametes incana)；15.松針層孔菌(Phellinus pini)；16.茶色擬迷孔菌；17.云芝(Coriolus versicolor)；18.紅緣擬層孔菌(Fomitopsis pinicola)；19.松木層孔菌(Phellinus pini)；20.平蓋靈芝(Ganodema applanatum)；子實體均采自黑龍江省伊春烏伊嶺，菌種由徐州師范大學江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室分離鑒定。

1.2 實驗用細胞

人非小肺癌細胞NCI-H460、人肝癌細胞HepG2、人肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 試劑與儀器

由圖1可見，不同多孔類真菌子實體乙醇提取物清除DPPH自由基的能力均隨質量濃度的增大而增強。各多孔類真菌清除DPPH自由基能力的大小順序為：榆生擬層孔菌＞松針層孔菌＞松木層孔菌＞紅肉擬層孔菌＞哈爾蒂木層孔菌＞紅緣擬層孔菌＞平蓋靈芝＞樺剝管孔菌＞絨毛栓菌＞毛栓菌。其中紅肉擬層孔菌、松針層孔菌、茶色擬迷孔菌、松木層孔菌4株多孔類真菌子實體乙醇提取物有較強的DPPH自由基清除能力，其EC50值均在0.5mg/mL左右。

IBE2000顯微鏡 Coic公司；CO2細胞培養(yǎng)箱 日本三洋公司；SpectroMax M2熒光檢測儀 Molecular Device公司；96孔細胞培養(yǎng)板 美國Gibco公司。

采用Alamar Blue法[10-11]檢測體外抗腫瘤細胞活性。人非小肺癌細胞NCI-H460，人肝癌細胞HepG2，人肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu于37℃、5% CO2的條件下在含10% 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用0.25g/100mL胰蛋白酶消化后制成細胞懸液濃度約為5×104個/mL，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加100μL，空白組加100μL不含細胞的培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁。然后加100μL樣品于實驗組中，空白組補加100μL培養(yǎng)基，對照組加入100μL含相同濃度DMSO的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次。Alamar Blue貯存液用培養(yǎng)基以1:10比例稀釋后，每孔加200μL，4h后將培養(yǎng)板放于570nm的激發(fā)波長和590nm的發(fā)射波長下檢測熒光值。抗癌藥物的活性以IC50衡量，IC50為抑制率為50%時藥物的濃度。按式(2)計算抑制率。

1.4 多孔類真菌乙醇提取物的制備

從表2可以看出，20株多孔類真菌子實體乙醇提取物對兩株細胞均具有一定的抗腫瘤活性，在500μg/mL時，其中樺剝管孔菌、絨毛栓菌、鈸孔菌、島生異擔子菌、榆生擬層孔菌、松針層孔菌、松木層孔菌、紅緣擬層孔菌、松木層孔菌、平蓋靈芝子實體乙醇提取物的抗腫瘤效果較強，抑制率均在90%左右，而其對應的菌絲體乙醇提取物抗腫瘤活性較弱，但部分多孔類真菌發(fā)酵液有很好的抗腫瘤活性，這也進一步說明在液體發(fā)酵過程中，部分菌絲體的代謝產物溶解于發(fā)酵液中。

由表4可知，滅菌溫度85℃時，酸奶凝乳不完全且質地較稀；滅菌溫度90℃時，酸奶凝乳均勻且質地黏稠適當；滅菌溫度95℃時，酸奶凝乳不均勻且有乳清析出。因此，產品的最佳滅菌溫度為90℃。

1.5 抗氧化活性實驗

式中：F代表對照組的熒光值；F0代表樣品組的熒光值；F1代表空白組的熒光值。

1.6 細胞培養(yǎng)與體外抗腫瘤細胞活性實驗

不想當將軍的士兵不是好士兵，一個有上進心的員工，必然會希望自己為企業(yè)帶來更高的價值，付出更多的努力來謀求更高的待遇。如果企業(yè)不能夠給員工一個良好的發(fā)展前景，那么員工的工作積極性勢必會消耗殆盡。例如酒店餐飲部，員工從一線服務員做起，然后是主管、領班、西餐廳經理，餐飲部經理。如果五星級酒店的領導職位沒有空缺，就缺少升職的空間，酒店中基層員工的需求量很大，但管理層相對來說流動率較低。因此，許多員工在基層崗位積累足夠多的經驗，如果沒有升職的機會就會選擇跳槽。

采用DPPH自由基清除法[9]。將乙醇提取物用50%的乙醇配成5、2.5mg/mL的受測液備用。取100μL的200μmol/L DPPH乙醇溶液和100μL的受測液加入96孔板中，混勻，室溫下放置30min后，在517nm波長處測吸光度(A0)，同時測定100μL DPPH溶液+100μL 50%乙醇混合液的吸光度(A1)和100μL受測液+100μL 50%乙醇混合液在波長517nm處的吸光度(A2)。EC50是清除活性為50%時對應的樣品濃度。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

準確稱5g多孔類真菌子實體和菌絲體，粉碎，按料液比1:20(m/V)加入75%乙醇溶液100mL，在55℃超聲提取50min，重復兩次，過濾所得液體減壓濃縮去除乙醇得浸膏，4℃保藏備用。樣品在細胞實驗前用二甲亞砜(DMSO) (各實驗組終體積分數(shù)為0.5%助溶，再以RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至各實驗濃度，對照組中加入相同濃度的DMSO。

2 結果與分析

2.1 20種多孔類真菌子實體和菌絲體乙醇提取物對DPPH自由基清除作用

DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基，本身為紫色物質，乙醇溶液的最大吸收峰處波長為517nm。DPPH自由基可以接受抗氧化劑提供的氫，使溶液紫色褪去，導致吸光度的變化，因而可以用于抗氧化活性的檢測，即DPPH法，與其他抗氧化檢測方法相比，該方法用時短且重復性好，因而被廣泛應用[12]。

表1 20種多孔類真菌子實體與菌絲體乙醇提取物對DPPH自由基的清除率比較Table 1 Comparison of scavenging activity of ethanol extracts from mycelia and fruit bodies of 20 polypores on DPPH free radicals%

從表1可以看出，20株多孔類真菌子實體、菌絲體乙醇提取物清除DPPH自由基的能力不同。其中樺剝管孔菌、絨毛栓菌、毛栓菌、榆生擬層孔菌、紅肉擬層孔菌、哈爾蒂木層孔菌、松針層孔菌、紅緣擬層孔菌、松木層孔菌、平蓋靈芝子實體乙醇提取物清除DPPH自由基的能力較強，在質量濃度5mg/mL時，清除率均超過70%。而島生異擔子菌、毛栓菌、紅緣擬層孔菌菌絲體乙醇提取物在質量濃度5mg/mL時，清除率均超過60%。從表1還可以看出，20種子實體乙醇提取物清除自由基活性大部分強于菌絲體，只有島生異擔子菌、毛栓菌、茶色擬迷孔菌、云芝菌絲體乙醇提取物清除DPPH自由基的能力高于它們相應的子實體乙醇提取物。

對其中清除DPPH自由基能力較強的10株多孔類真菌子實體乙醇提取物進行復測，對DPPH自由基清除能力如圖1所示。

圖1 10株多孔類真菌子實體乙醇提取物的DPPH自由基清除活性Fig.1 Scavenging activity of ethanol extracts from fruit bodies of 10 polypores fungi on DPPH free radicals

Alamar Blue 美國Sigma公司；胎牛血清 杭州四季青公司；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶 南京生興生物技術有限公司；RPMI 1640 美國Gibco公司；DMSO及其他試劑均為國產分析純。

2.2 20種多孔類真菌乙醇提取物及發(fā)酵液對腫瘤細胞增殖的影響

采用NCI-H460和HepG2兩株癌細胞，通過Alamar Blue法對20種多孔類真菌子實體乙醇提取物、菌絲體乙醇提取物及其相應的發(fā)酵液進行抗腫瘤活性檢測，結果見表2。

圖2 10株多孔類真菌子實體乙醇提取物對3株腫瘤細胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of ethanol extracts from 10 polypores fungi on proliferation of three cancer cell lines

多孔類真菌液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g，水1000mL；液體培養(yǎng)條件為：160r/min、26℃、10d后停止培養(yǎng)，收集菌絲并冷凍干燥。

表2 20株多孔類真菌子實體和菌絲體乙醇提取物及發(fā)酵液抗腫瘤活性比較Table 2 Comparison of anti-tumor effects of ethanol extracts from fermented mycelia and fruit bodies of 20 polypores fungi and fermentation broth

對具有較強抗腫瘤活性的10株多孔類真菌子實體乙醇提取物進行抗腫瘤活性復測，并檢測了乙醇提取物對人肝癌細胞Bel-7402/5-Fu耐藥株的細胞毒性。如圖2所示，10株多孔類真菌子實體乙醇提取物對細胞株NCIH460、HepG2和Bel-7402/5-Fu均有較高的抗腫瘤活性，但對耐藥細胞株的IC50值均略高于非耐藥細胞株，且抗腫瘤活性與提取物質量濃度存在明顯的量-效關系。其中鈸孔菌、紅緣擬層孔菌子實體乙醇提取物對3株癌細胞的IC50值均低于100μg/mL。

合規(guī)概念的使用始于會計金融領域。目前，合規(guī)風險指“不符合法律規(guī)定”所導致的風險，是企業(yè)在經營活動中，由于內部控制和治理機制不完善，企業(yè)活動未能與法律、法規(guī)、制度、政策、行業(yè)規(guī)則等有關規(guī)范保持一致，而可能面臨主管或司法機關處罰的風險。

PJI分子生物學診斷方法有其獨特的優(yōu)點，如快速、低成本，不低于常規(guī)診斷方法的敏感性與特異性，不僅能診斷感染及其病原菌，而且可鑒定出抗生素耐藥性基因，尤其適用于細菌培養(yǎng)陰性、近期使用抗生素、以及低毒力細菌感染的患者。但同時缺點也較為明顯，如假陽性率較高、診斷局限于特定范圍的細菌、需要特定的設備、不能提供藥敏結果以直接指導臨床抗生素應用等。但必須肯定的是，就目前PJI診斷治療的臨床研究來看，分子生物學診斷是PJI常規(guī)診斷方法的重要補充，有其特定的臨床價值。

3 討 論

自然界存在的真菌種類繁多，從這些真菌中是否能尋找到抗氧化和作用機制新穎的抗腫瘤成分是開發(fā)抗氧化、抗腫瘤新藥的基礎工作。過去對多孔類真菌抗腫瘤作用的報道中指出多孔類真菌具有抗腫瘤作用的活性成分，如桑黃中β-1,3-葡聚糖在C6有葡萄糖分支的具有較好的抗癌效果[13]。但也有報道指出在多孔類真菌中存在除多糖以外的抗腫瘤化合物。等[14]和Faldt等[15]從多孔類真菌中分離出麥角甾醇類衍生物及靈芝酸等羊毛甾烷類三萜化合物。Chieoko等[16]從一些真菌中分離出了一些具有較好抗氧化作用的化合物。綜合國內外研究報道，多孔菌代謝產物的多樣性表現(xiàn)為多糖、萜類、甾醇類、多肽、吡喃類化合物、黃酮和香豆素類化合物等結構類型，同時，這些多種結構類型的代謝產物具有抗腫瘤、抗氧化、護肝、抗炎、抗病毒、抗菌、抗蟲、溶血和降低膽固醇等多種生物活性。

重視農村經濟發(fā)展問題，關乎著我國社會主義現(xiàn)代化事業(yè)進程，影響著廣大農民的收入水平。為此，我國要重視農村經濟發(fā)展，把農村經濟發(fā)展理念立于我國長遠國家戰(zhàn)略計劃中，行于社會主義現(xiàn)代化建設進程中。只要國家、政府和人民凝聚力量，齊心協(xié)力全方位搞農村經濟發(fā)展，一定能夠振興鄉(xiāng)村經濟，推進新農村建設，確保農民收入持續(xù)增長，從而不斷提升農民生活質量和生活水平。

應用降脂湯結合針灸治療高脂血癥127例患者，其療效為顯效92例，有效28例，無效及惡化7例?？傆行?4.5%。

本實驗采用清除DPPH自由基法和Alamar Blue法對供試的20種多孔類真菌子實體和菌絲體乙醇提取物進行檢測篩選，為今后分離出具體活性物質提供依據(jù)，結果表明其中10株多孔類真菌子實體乙醇提取物具有較好的DPPH自由基清除能力或抗腫瘤活性，并對它們抗氧化和抗腫瘤活性的強弱進行了比較，其中有8株多孔類真菌子實體乙醇提取物既具有較好的DPPH自由基清除能力又有較強的抗腫瘤活性。結果還表明，20種多孔類真菌子實體的活性大部分強于菌絲體，這可能與液體發(fā)酵過程中，菌絲體代謝的部分活性物質溶解于發(fā)酵液中或發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、發(fā)酵時間、溶氧量等對多孔類真菌活性物質的產生與積累有一定的關系。對于本實驗中子實體乙醇提取物的活性較高，而對應的菌絲體乙醇提取物和發(fā)酵液活性較低的菌株，發(fā)酵條件有待進一步優(yōu)化。優(yōu)化后可以進行深層發(fā)酵來獲得大量菌絲體及發(fā)酵液。由此，不論從經濟成本還是從藥理活性上看，深層發(fā)酵獲得要比天然野生的多孔菌更具有開發(fā)利用的價值，也可以解決近年來過度采集所造成的自然資源不足的問題，這方面的工作目前也正在進行。

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Comparisons on Antioxidant and Anti-tumor Activity of Ethanol Extracts from 20 Polypores Fungi in vitro

CHEN Yong-qiang，CHEN Xian-hui，SUN Yong，MIAO Qian，WANG Li，JIANG Ji-hong*
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, China)

The antioxidant activities of ethanol extracts from the mycelia and fruit bodies of twenty polypores fungi were evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging method. Meanwhile, these extracts were tested for their anti-tumor activities by Alamar Blue method. The results showed that the DPPH free radical scavenging and anti-tumor activities of the extracts from fruit bodies of each of these fungi were significantly higher than those of the extracts from mycelia.A DPPH radical scavenging rate of 70% was observed for the ethanol extract of fruit body at a concentration of 5 mg/mL, and the inhibition rates of the ethanol extract against two cancer cell lines such as non-small lung cancer cell NCI-H460 and human hepatoma cell HepG2 were both around 90% at 500 μg/mL. In addition, compared with the normal cell lines, a slightly low inhibition rate of the ethanol extract on drug-resistant cells such as Bel-7402/5-Fu was also observed.

polypores；antioxidation；DPPH free radical； anti-tumor activity

TS201.2

A

1002-6630(2011)05-0027-05

2010-06-14

國家“863”計劃項目(2007AA021506)；江蘇省高校自然科學重大基礎研究項目(08KJA350001)

陳永強(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：chenyongqiang_163@163.com

*通信作者：蔣繼宏(1962—)，男，教授，博士，研究方向為資源微生物及生物技術。E-mail：jhjiang@xznu.edu.cn