堿性果膠酶產(chǎn)生菌Bacillus claussi XJU-8的分離鑒定及酶學(xué)特性分析

古麗斯瑪依·艾拜都拉，艾尼江·爾斯?jié)M，木合塔·阿不都克里木,*，謝仁娜依·甫拉提，孜來(lái)古麗·米吉提，趙 建，艾爾肯·熱合曼

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054 )

堿性果膠酶產(chǎn)生菌Bacillus claussi XJU-8的分離鑒定及酶學(xué)特性分析

古麗斯瑪依·艾拜都拉1，艾尼江·爾斯?jié)M1，木合塔·阿不都克里木1,*，謝仁娜依·甫拉提2，孜來(lái)古麗·米吉提1，趙 建1，艾爾肯·熱合曼1

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054 )

從新疆石河子市一處工業(yè)污水(pH11.0)中分離到一株堿性果膠酶產(chǎn)生菌，編號(hào)XJU-8。應(yīng)用形態(tài)學(xué)檢測(cè)、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)菌株進(jìn)行多相鑒定。XJU-8可在pH5.0～13.0的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度37℃。16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明XJU-8與Bacillus claussi類(lèi)聚在一起，而且序列同源性高達(dá)99%以上。XJU-8與B.claussi GMBAE 42在氧化酶，檸檬酸鹽利用和水解Tween-40、Tween-60上有差異，且XJU-8有寬范圍pH值耐受性，被認(rèn)為是B.claussi的一個(gè)新品系。該菌產(chǎn)生的堿性果膠酶最適pH10.0，最適溫度50℃，在pH9.0～12.0有較高活性和穩(wěn)定性。酶活性可被Ca2+鹽激活。XJU-8所產(chǎn)堿性果膠酶特性良好，工業(yè)應(yīng)用潛能巨大。

Bacillus claussi；16S rDNA；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；堿性果膠酶

果膠是細(xì)胞間質(zhì)和高等植物初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的主要多糖[1]。作為細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞壁的成分，果膠是一種天然的物質(zhì)，而且是所有水果蔬菜的主要成分?；瘜W(xué)成分上它是一種以側(cè)鏈甲基化的D-半乳糖醛酸為骨架形成的雜多糖[2-3]。

果膠酶是具有果膠降解活性的一種酶，在食品工業(yè)中用于提高產(chǎn)品質(zhì)量和果汁的透明度[4]，在紡織工業(yè)中廣泛地應(yīng)用于亞麻莖脫纖維，代替了傳統(tǒng)的脫膠工藝[5]。微生物果膠酶在人類(lèi)生產(chǎn)活動(dòng)中具有不可替代的用途，目前酸性果膠酶已廣泛應(yīng)用于果膠的提取、果汁和酒類(lèi)的澄清中[4,6]。堿性果膠酶主要用于蔬菜食品加工廠排出的含果膠質(zhì)的污水預(yù)處理和大麻、苧麻、亞麻、黃麻等植物纖維的加工、脫膠及解聚等領(lǐng)域[5]。細(xì)菌、酵母、放線菌等多種微生物資源中可以獲得果膠酶[6-9]。酵母主要產(chǎn)酸性果膠酶，而細(xì)菌中主要是芽孢桿菌屬的菌種產(chǎn)堿性果膠酶[10-11]。果膠酶作為重要的工業(yè)酶之一，在生物技術(shù)領(lǐng)域有相當(dāng)可觀的應(yīng)用價(jià)值，其應(yīng)用范圍包括紡織加工、植物韌皮纖維的脫膠、果膠污水的處理、造紙業(yè)、咖啡和茶葉的發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域[5]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)從新疆石河子一處堿性廢水中分離得到的菌株XJU-8用形態(tài)學(xué)、生理生化及分子遺傳學(xué)的方法進(jìn)行多相鑒定，并對(duì)該菌株分泌的堿性果膠酶的酶學(xué)特性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

菌株XJU-8是從新疆石河子市一處污水廠的水樣中分離得到。

果膠瓊脂培養(yǎng)基：果膠0.5g、酵浸粉0.5g、KH2PO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、瓊脂2g、pH10，蒸餾水定容至100mL；產(chǎn)果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基：果膠粉1g、酵母膏0.5g、NH4SO40.2g、K2HPO40.2g、MgSO40.2g、FeSO40.0001g、NaCl 0.03g，pH10，用蒸餾水定容至100mL。

EDTA-2Na、Tris、十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)、溴化乙錠(EB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、瓊脂糖(Agarose) 上海Sangon公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

170-6701PCR儀、Gel Doc XR 170-8170凝膠成像儀美國(guó)伯樂(lè)公司；DYCP-31D水平電泳儀 北京六一儀器廠；GoldS54T紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 菌株的篩選

從堿性污水中所采集的樣品在0.9% NaCl溶液中稀釋。涂布到果膠瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)3d獲得菌落。在單菌落周?chē)尤霂椎?% CTAB，靜置10min，若有透明圈產(chǎn)生則為堿性果膠酶產(chǎn)生菌[12]。根據(jù)透明圈直徑和透明度，菌株XJU-8被認(rèn)為是堿性果膠酶產(chǎn)生菌。該菌株保藏于中國(guó)典型菌株保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC AB 207169。

1.4 菌株的生理及形態(tài)學(xué)特性

用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。表型特征檢測(cè)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行。

1.5 16S rDNA 擴(kuò)增及序列分析

基因組DNA的提取與純化根據(jù)Saito等[15]的方法進(jìn)行。所用的引物是16S rDNA PCR通用正向引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和通用反向引物1492R (5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)[16]。測(cè)定的堿基序列用MEGA軟件(可從http://www.megasoftware.net/MEGA3.1獲得)拼接[17]。菌株的16S rDNA 基因序列提交到GenBank(注冊(cè)號(hào)：EF643510)。

為了根據(jù)同源程度初步確定菌株XJU-8的分類(lèi)學(xué)地位，采用ClustralXversion1.8進(jìn)行多序列比對(duì)后，用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，應(yīng)用自展法(Bootstrap)檢測(cè)系統(tǒng)樹(shù)，循環(huán)1000次，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 基因組G+C含量測(cè)定

根據(jù)Tamaoka等[18]所描述的方法進(jìn)行基因組G+C含量測(cè)定。

1.7 堿性果膠酶活力測(cè)定

1.7.1 粗酶液的制備

將50mL發(fā)酵培養(yǎng)基用0.5mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種，最終OD600nm為0.6 ，在37℃培養(yǎng)72h，7000×g 離心10min，取上清液用做酶活性分析。

1.7.2 酶活力測(cè)定

采用3,5 - 二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定酶活力[19]。取0.4g/100mL果膠溶液1mL，加入1mL粗酶液，50℃水浴反應(yīng)30min，取出煮沸5min，最終產(chǎn)物加入2.0mL DNS試劑，沸水浴加熱2min，冷卻后定容至25mL。取經(jīng)加熱煮沸10min 的失活酶液代替原酶液作空白對(duì)照。于520nm 波長(zhǎng)處測(cè)光密度OD520nm。酶活力單位定義為每小時(shí)每毫升酶液由底物產(chǎn)生1mg還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需的酶量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次，求得其平均值。

1.7.3 pH值對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響

用不同的pH值(3.0～13.0)緩沖液配制底物，底物為質(zhì)量濃度0.4g/100mL果膠溶液，加入1mL粗酶液，將不同的pH值反應(yīng)體系置于50℃反應(yīng)30min，測(cè)定酶活力。所用緩沖液(0.2mol/L)有：Na2HPO4-磷酸檸檬酸緩沖液(pH3.0～8.0)、氨基乙酸-NaOH緩沖液(pH9.0～10.0)、Na2HPO4-NaOH緩沖液(pH11.0)和KCl-NaOH 緩沖液(pH12.0～13.0)。為了檢測(cè)果膠酶的pH值穩(wěn)定性，酶在不同緩沖液中處理1h。酶活力按照1.7.2節(jié)方法測(cè)定，以最大酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.7.4 溫度對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響

底物為0.4g/100mL果膠溶液，加入1mL粗酶液，溫度在30～90℃、pH10.0(0.2mol/L 氨基乙酸-NaOH緩沖液)條件下水浴反應(yīng)，30min后測(cè)定酶活力。40、50、60℃條件下保溫1h后，以未經(jīng)保溫處理的酶液為對(duì)照，每隔20min測(cè)定酶活力。以最大酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.7.5 不同金屬離子對(duì)堿性果膠酶活性的影響

底物為0.4g/100mL果膠溶液，加入1mL粗酶液，分別向酶與底物混合液中加入不同的金屬離子，使其最終濃度為5mmol/L，測(cè)定其酶活力，以不加金屬離子的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。采用的試劑有：CaCl2·2H2O、FeCl3、CoCl2、ZnSO4·7H2O、CuSO4、HgCl2。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)及生理生化特征

在果膠瓊脂培養(yǎng)基上篩選的眾多菌落中，菌株XJU-8形成的透明圈直徑最大，透明度最好(圖1)。這一結(jié)果顯示該分離菌株是一株良好的果膠酶生產(chǎn)菌，并且在果膠瓊脂培養(yǎng)基上能向胞外分泌果膠酶。菌株XJU-8為革蘭氏陽(yáng)性、桿狀、好氧、無(wú)運(yùn)動(dòng)性、有芽孢的嗜堿菌。在透射電子顯微鏡下細(xì)胞為桿狀((0.7～0.9)μm×(2.0～4.8)μm)， 沒(méi)有鞭毛(圖2)。該細(xì)菌擁有比較寬的pH值耐受范圍(pH5.0～13.0)，最適pH值為10.5，是一個(gè)極端耐堿的菌株。它的生長(zhǎng)溫度范圍是10～60℃，最適溫度是37℃，對(duì)NaCl 耐性高達(dá)15%。

圖1 初篩菌株在篩選平板上形成的透明圈Fig.1 Clear halos on screening plate formed by priliminarily screened strain

XJU-8和模式菌株B. claussi GMBAE 42[20]的表型和化學(xué)分類(lèi)學(xué)特征見(jiàn)表1。XJU-8顯示的極其有限的不同點(diǎn)如下： 能在50～60℃的溫度條件和pH5.0～13.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)繁衍，而且能水解Tween-40、Tween-60，沒(méi)有氧化酶活性，并且不能利用檸檬酸鹽作為碳源。這兩株菌都可以水解干酪素和淀粉，不能水解Tween-20、Tween-80、精氨酸、賴氨酸、尿素等；在形態(tài)及生理生化特征上顯示出很高的一致性。

圖2 透射電子顯微鏡下的Bacillus claussi XJU-8Fig.2 Transmission electron micrograph of Bacillus claussi XJU-8

表1 菌株B.claussi XJU-8和B.claussi GMBAE 42的形態(tài)及生理生化特征Table 1 Morphological, physiological and biochemical characteristics of B. claussi XJU-8 and B. claussi GMBAE 42

2.2 16S rDNA 序列分析及G+C含量

對(duì)XJU-8 16S rDNA 序列進(jìn)行測(cè)序獲得1401nt的堿基序列(GenBank 注冊(cè)號(hào)：EF643510)。序列比對(duì)結(jié)果表明，該菌株與Bacillus clausii的DNA序列相似率最高，高達(dá)99%以上。利用MEGA3.1軟件對(duì)芽孢桿菌屬的20株菌構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖 3。XJU-8與其他B.claussi菌株緊密的聚集在同一個(gè)分支上，而且靴帶值為100%。XJU-8的G+C含量為43.67%，與B. clausii的DNA G+C含量的變異范圍(42.8～45.5mol %)吻合?；谏鲜鲂螒B(tài)及生理生化特征，16S rDNA 相似率，系統(tǒng)進(jìn)化分析和G+C含量的結(jié)果，將新分離到的細(xì)菌精確鑒定為Bacillus clausii XJU-8。

圖3 利用16S rDNA同源序列和鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis (Kimura 2-parameter model) and 16S RNA sequences

2.3 果膠酶活性

2.3.1 最適反應(yīng)溫度及穩(wěn)定性

如圖4所示，該果膠酶的最適溫度為50℃，在反應(yīng)溫度低于50℃時(shí)隨著溫度升高酶活力增加，當(dāng)高于50℃時(shí)隨著溫度升高酶活力迅速下降。在同樣恒定的溫度條件下，該果膠酶的活性表現(xiàn)較為穩(wěn)定。

圖4 溫度對(duì)果膠酶活性(a)和穩(wěn)定性(b)的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of alkaline pectinase

2.3.2 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性

圖5 pH值對(duì)果膠酶活性pH(a)和穩(wěn)定性(b)的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of alkaline pectinase

由圖5a可見(jiàn)，50℃條件下，果膠酶在pH3.0～13.0范圍內(nèi)均有活性，酸性條件下酶活性很低，pH值高于7時(shí)，酶活力明顯上升，最適pH值為10，pH值高于12時(shí)酶活性急劇下降。由圖5b可見(jiàn)，果膠酶活力在pH9～12能保持較高穩(wěn)定性，在此pH值條件下處理1h，XJU-8 產(chǎn)生的果膠酶的酶活力仍能保持在80%以上，充分的顯示該酶在強(qiáng)堿性條件下具有較高的穩(wěn)定性。

2.3.3 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響

表2 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響Table 2 Effects of metal ions on the activity of alkaline pectinase

由表 2 可見(jiàn)，F(xiàn)e3+、Co2+、Zn2+、Cu2+和 Hg2+離子均可對(duì)酶的活性產(chǎn)生抑制作用，其中Hg2+的抑制作用最為顯著，可使酶的活力降低到原始活力的23.13%。Ca2+具有增大果膠酶活力的作用，可使酶的活力提高到原始活力的114.76%。

3 結(jié) 論

菌株XJU-8 在果膠培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而且能向胞外產(chǎn)生果膠酶。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化檢測(cè)、16S rDNA序列同源性、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析和G+C含量的測(cè)定分析，本實(shí)驗(yàn)將新分離到的細(xì)菌XJU-8鑒定為Bacillus clausii XJU-8(EF643510，CCTCC AB 207169)。菌株 XJU-8 有很廣闊的pH值(5.0～13.0)生長(zhǎng)范圍，它的最高pH值耐受值為13.0，極可能成為其他堿性酶類(lèi)潛在的提供者。菌株XJU-8 產(chǎn)生的果膠酶最適反應(yīng)溫度為50℃，略高于以前所報(bào)道過(guò)的菌株Bacillus sp. WSHB04202(45℃)[21]，但是比B. subtilis(65℃)[22]和B. stearothermophilus(70℃)低。該酶的耐堿范圍比以前所報(bào)道過(guò)的Bacillus sp.WSHB04202 (pH9.4)[21]，Bacillus stearothermophillus(pH9.0)[23]和B. subtilis(pH9.0)[23]都高，此菌株所產(chǎn)生的堿性果膠酶耐堿特性突出；在堿性(pH9～12)環(huán)境中比較穩(wěn)定，而且在此條件處理1h仍然能保持80%以上的酶活性。Ca2+能使酶活性提高14.76%，可以看作是催化劑。菌株Bacillus clausii XJU-8及其堿性果膠酶在紡織工業(yè)、植物纖維的處理、咖啡和茶的發(fā)酵、油的提取、污染果膠污水的處理等工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

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Isolation and Identification of Bacillus claussi XJU-8 and Enzymatic Properties of Its Slkaline Pectinase

Gulsumay HABIBULLA1，Ghenijan OSMAN1，Muhtar ABDUKERIM1,*，Shirenay PULAT2，Zilaygul MIJIT1，

ZHAO Jian1，Erkin RAHMAN1
(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University,830046, China；2. College of Life Science and Chemistry, Xinjiang Normal University,830054, China)

A bacterial strain designated as XJU-8 was isolated from alkaline sewage samples from Shihezi city, Xinjiang. This bacterial strain was a gram-positive, spore-forming, aerobic bacillus. It could grow in LB medium with a broad range of pH(5.0 － 13.0). The optimal growth conditions for this bacterial strain were 37 ℃ and pH 10.5. Its tolerance to NaCl was up to 15%. The 16S rRNA gene sequence analysis showed that the strain XJU-8 was highly related to B. claussi with 99% similarity.The G+C content in its genomic DNA was 43.67%. The strain XJU-8 was confirmed as B. claussi by comparing its physiological,biochemical and genetic characteristics with those of B. claussi GMBAE 42. Due to its excellent pH tolerance and several phenotypic characteristics, this strain was further confirmed and classified as a new member of B. claussi species. This strain also could produce an extracellular alkaline pectinase with the maximum enzyme activity at 50 ℃ and pH 10.0. More than 80% activity of this alkaline pectinase was remained at pH value ranging from 9.0 to 12.0. The activity of the alkaline pectinase could be enhanced in the presence of Ca2+. These properties demonstrated that this enzyme might be suitable for paper-making, coffee and tea fermentation, textile industries and other industrial applications.

Bacillus claussi；16S rDNA；phylogenetic analysis；alkaline pectinase

Q93.331

A

1002-6630(2011)05-0182-05

2010-04-20

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(201091236)；科技部教學(xué)實(shí)驗(yàn)用微生物菌種資源子項(xiàng)目(2005DKA21208-9)；

新疆特殊環(huán)境實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(XJYS0203-2010-5)

古麗斯瑪依·艾拜都拉(1963—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)橘Y源微生物。E-mail：gulsimay2005@sina.com

*通信作者：木合塔·阿不都克里木(1962—)，男，副教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槲⑸镞z傳。E-mail：muhtar97@sina.com