堿性芽孢桿菌木聚糖酶基因的克隆及表達(dá)

陳 娜，生吉萍，申 琳*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

堿性芽孢桿菌木聚糖酶基因的克隆及表達(dá)

陳 娜，生吉萍，申 琳*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

本實(shí)驗(yàn)從廣西紅樹(shù)林土壤中篩選出一株產(chǎn)木聚糖酶的耐堿菌HSL38，經(jīng)過(guò)16S rDNA鑒定，其與堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性達(dá)到99%。參考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10，其與xynA的同源性達(dá)到99%，編碼396個(gè)氨基酸殘基(45.27kD)，屬于糖基水解酶GH10家族。將xyl-BH-G10基因與表達(dá)載體pET-30a-c(+)連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。結(jié)果表明，在最佳誘導(dǎo)條件下，木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，酶活力達(dá)到55.28U/mL，是原菌株HSL38發(fā)酵液酶活力的4倍。

堿性芽孢桿菌；木聚糖酶；克?。槐磉_(dá)

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，其最終的降解產(chǎn)物是自然界中重要的可再生資源[1]。木聚糖酶是一組可降解木聚糖的水解酶系，主要有β-1,4-木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酶，其中β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是木聚糖酶解過(guò)程中的關(guān)鍵酶[2-4]。木聚糖酶在自然界中分布廣泛，存在于各種真菌、放線菌、細(xì)菌、植物、動(dòng)物瘤胃等環(huán)境中，因此不同的木聚糖酶，氨基酸組成差異較大，根據(jù)酶催化區(qū)域的保守性，木聚糖酶主要?dú)w屬于糖基水解酶GH10族和GH11族，高分子質(zhì)量酶(大于30kD)多屬于GH10族，低分子質(zhì)量酶多屬于GH11族[5]。通過(guò)分析酶的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶由催化區(qū)和非催化區(qū)組成，其中非催化區(qū)包括纖維素結(jié)合區(qū)、木聚糖結(jié)合區(qū)、熱穩(wěn)定區(qū)等，決定酶的溫度和pH值穩(wěn)定性以及底物的專(zhuān)一性[1]。

微生物對(duì)木聚糖酶的分泌具有可誘導(dǎo)性，在富含純木聚糖或木聚糖殘?jiān)呐囵B(yǎng)基中，一些微生物的產(chǎn)酶量會(huì)增加，通常在木糖誘導(dǎo)下會(huì)促進(jìn)產(chǎn)酶，在葡萄糖誘導(dǎo)下卻抑制產(chǎn)酶[6]。在工業(yè)生產(chǎn)中，木聚糖酶可配合其他水解酶使用，降解植物半纖維素組織，獲得低聚木糖及其下游分解產(chǎn)物資源。因此被廣泛應(yīng)用于食品加工、飼料生產(chǎn)、制漿造紙、能源工業(yè)等行業(yè)，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景[7]。堿性木聚糖酶可用于紙漿漂白工藝，減少環(huán)境污染，越來(lái)越受到人們的關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。本研究從堿性環(huán)境中篩選得到耐堿性強(qiáng)的具有木聚糖酶活性的芽孢桿菌，擴(kuò)增獲得木聚糖酶基因全序列，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤樣品：廣西紅樹(shù)林土壤。

限制性?xún)?nèi)切酶、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 大連寶生物工程有限公司；Easypfu DNA聚合酶、DNA Marker、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、細(xì)菌總DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；卡那霉素 北京全新拓達(dá)公司；樺木木聚糖、SDS、Tris-Base、EDTA、IPTG 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基

大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pEASYBlunt-Simple載體 北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-30a-c(+)載體 本實(shí)驗(yàn)室保存。

LB培養(yǎng)基(1L)：10g胰蛋白胨、5g酵母膏、10g NaCl，pH7.0。固體培養(yǎng)基加入1.5%～2.0%瓊脂粉。堿性培養(yǎng)基(1L)：NaCl 20.0g、KH2PO42.0g、MgSO4·7H2O 1.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖1.0g、瓊脂粉20.0g，121℃滅菌20min；Na2CO310.0g溶于1L水中，過(guò)濾滅菌后與上述所配溶液混合。木聚糖酶篩選培養(yǎng)基(1L)：固體LB中加入1%樺木木聚糖?？敲顾乜剐耘囵B(yǎng)基(1L)：LB培養(yǎng)基加入卡那霉素(Kan)，終質(zhì)量濃度為20mg/L。

1.3 方法

1.3.1 耐堿菌株的篩選

參考吳萍等[9]的方法稍作改變，稱(chēng)取土壤樣品5g，放入裝有45mL無(wú)菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，于水平搖床上振蕩約30min。將梯度稀釋后的菌懸液涂布于堿性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5～7d。劃線純化出單菌落，保存。

將篩選出的耐堿菌點(diǎn)接于木聚糖酶篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2d，觀察水解圈。

1.3.2 木聚糖酶活性測(cè)定

參考Bailey等[10]的方法測(cè)定木聚糖酶活力。取100μL酶液加入900μL 0.5mol/L pH 6.8的Tris-HCl 緩沖液配成的質(zhì)量濃度為2g/100mL木聚糖溶液，50℃水浴酶解15min。取250μL酶解液，加入750μL DNS，沸水浴反應(yīng)10min，立即放入冰中冷卻。加入5mL 蒸餾水，混勻，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以沸水浴15min滅活的酶液為對(duì)照。酶活力單位(U)：每毫升酶液每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1μmol木糖的量。

1.3.3 細(xì)菌總DNA提取及16S rDNA鑒定

使用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取總DNA，以總DNA為模板，以27F和1492R為引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA[11]。27F：5＇-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT -3＇；1492R：5＇-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3＇。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.3.4 木聚糖酶基因的克隆

以細(xì)菌DNA為模板，參考?jí)A性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)木聚糖酶基因xynA設(shè)計(jì)引物。為了避免PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)非特異性條帶，本實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR的方法，擴(kuò)增菌株HSL38的木聚糖酶基因xyl-BH-G10。

在木聚糖酶基因開(kāi)放式閱讀框(ORF)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物F1和F2。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。切膠回收約2400bp的片段，用作下一步PCR的模板。

使用分別加入酶切位點(diǎn)Bgl Ⅱ和XhoⅠ的引物F3和F4，以第一步PCR后膠回收片段為模板進(jìn)行第二步PCR。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。切膠回收約1200bp的片段，取4μL膠回收產(chǎn)物與1μL克隆載體pEASY-Blunt-Simple平末端連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

表1 巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers

1.3.5 表達(dá)載體及大腸桿菌重組子構(gòu)建

提取重組質(zhì)粒pEASY-Blunt-Simple-xyl-BH-G10，使用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ雙酶切，膠回收目的片段xyl-BH-G10(約1200bp)。取目的片段與酶切后的載體pET-30a-c(+)于4℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，于37℃培養(yǎng)12～16h，菌液PCR篩選陽(yáng)性重組子。

1.3.6 基因序列分析

基因全長(zhǎng)序列及開(kāi)放閱讀框使用DNAMAN 6.0軟件分析。使用ClustalX、BLAST軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。使用ProtParam tool對(duì)其分子質(zhì)量、pI值等進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.7 大腸桿菌重組子的培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)

參考胡春霞等[12]的方法并改進(jìn)，大腸桿菌重組子經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，采用0.5mmol/L IPTG，32℃、200r/min誘導(dǎo)6h，表達(dá)重組蛋白，并以攜帶空載體pET-30a-c(+)的菌株和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株為對(duì)照。收集超聲波破碎后菌體裂解液上清和沉淀，進(jìn)行蛋白電泳分析。

1.3.8 重組蛋白活性分析及其酶活測(cè)定

蛋白電泳[13]和活性電泳分析[14]：在分離膠中加入0.5g/100mL的木聚糖，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，使用25%異丙醇溶液于脫色搖床上振蕩膠塊30min，再使用0.5mol/L pH6.8的Tris-HCl緩沖液于4℃浸泡4次，每次30min，于50℃水浴反應(yīng)1h，0.1g/100mL的剛果紅染色30min，加入0.5%醋酸溶液，膠片觀察燈下觀察水解圈。

分別測(cè)定經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株E.coli pET-30a-c(+)-xyl-BH-G10裂解液上清及菌株HSL38在37℃、200r/min發(fā)酵12h后上清液的酶活力，并以攜帶空載體的菌株和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株裂解液酶活力為對(duì)照。各菌株均接種3瓶，分別收集酶液測(cè)定酶活力，用Excel 2007軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐堿菌株的篩選及鑒定

堿性培養(yǎng)基pH值范圍為10.5～11.0，利用其篩選出耐堿性的微生物。將篩選所得耐堿微生物接種于木聚糖酶篩選培養(yǎng)基中，篩選得到具有木聚糖酶活性的菌株HSL38。16S rDNA鑒定與堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans同源性達(dá)99%。初步鑒定菌株HSL38屬于Bacillus halodurans。

2.2 木聚糖酶基因的擴(kuò)增及序列分析

圖1 xyl-BH-G10基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophorogram of PCR amplified product of xyl-BH-G10 gene

根據(jù)菌株HSL38 16S rDNA鑒定結(jié)果，以Bacillus halodurans C-125的木聚糖酶基因xynA為參考，設(shè)計(jì)巢式PCR引物，進(jìn)行擴(kuò)增，最終得到約1200bp的片段，與xynA基因大小相符，結(jié)果見(jiàn)圖1。

將基因xyl-BH-G10的PCR產(chǎn)物切膠回收，與克隆載體pEASY-Bunt-Simple進(jìn)行平末端連接，藍(lán)白斑篩選，獲得陽(yáng)性克隆，并測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖2。

基因xyl-BH-G10 與Bacillus halodurans C-125的xynA基因同源性達(dá)到99%，蛋白序列一致，編碼396個(gè)氨基酸殘基，屬于糖基水解酶GH10家族。根據(jù)劉亮偉等[15]對(duì)木聚糖酶分子進(jìn)化的研究表明，GH10家族的木聚糖酶從生物進(jìn)化方面來(lái)看，其來(lái)源于高溫環(huán)境；從三維結(jié)構(gòu)來(lái)看，其結(jié)構(gòu)為(β/α)8折疊桶，可結(jié)合更小的底物，產(chǎn)物中單糖較多。因此推測(cè)木聚糖酶xyl-BH-G10的溫度穩(wěn)定性較高，分解底物較徹底。利用ProtParam tool預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為45.27kD，pI值為4.66，融合His標(biāo)簽的重組蛋白分子質(zhì)量為49.31kD。

2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

提取質(zhì)粒pEASY-Blunt-Simple-xyl-BH-G10和質(zhì)粒pET-30a-c(+)，使用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ雙酶切質(zhì)粒，分別切膠回收約1200bp(xyl-BH-G10)和約5400bp(pET-30a-c(+)線性載體)，在T4 DNA連接酶的作用下，4℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，菌液PCR鑒定為陽(yáng)性菌株。

圖3 重組載體及其酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid and restriction digestion

2.4 木聚糖酶基因xyl-BH-G10的表達(dá)

以帶有空載體的菌株E.coli BL21(DE3)-pET-30a-c(+)和未誘導(dǎo)的菌株E.coli BL21(DE3)-pET-30a-c(+)-xyl-BH-G10為對(duì)照。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體裂解上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 重組大腸桿菌菌株裂解液SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of cell lysate of recombinant E. coli

從蛋白電泳可以看出，基因xyl-BH-G10在大腸桿菌中發(fā)生了截?cái)啾磉_(dá)，可能是由于蛋白水解酶將蛋白降解，也可能因?yàn)槌霈F(xiàn)了新的翻譯起始點(diǎn)[16]。分析基因xyl-BH-G10的序列，發(fā)現(xiàn)在+90處存在RBS(核糖體結(jié)合位點(diǎn))AGGAGG，通過(guò)GENSCAN在線分析軟件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)找出其開(kāi)放式閱讀框，并預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為34.92kD，可能是木聚糖酶成熟蛋白。圖4顯示，在預(yù)測(cè)木聚糖酶成熟蛋白約35kD處有明顯的蛋白條帶，在約49kD處的蛋白條帶，大小與加了His標(biāo)簽的木聚糖酶重組蛋白相似。并且，攜帶空載體的菌株在約35kD和約49kD處無(wú)蛋白表達(dá)，未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株有微量的本底表達(dá)。同時(shí)，從裂解液沉淀處的蛋白條帶可以看出，在本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)表達(dá)條件下有部分包含體形成。于是，進(jìn)一步進(jìn)行活性電泳驗(yàn)證重組蛋白活性。

2.5 重組蛋白活性分析及其酶活力

圖5 重組大腸桿菌菌株裂解液SDS-PAGE和活性電泳Fig.5 SDS-PAGE and native gel electrophoresis of cell lysate of recombinant E. coli

利用活性電泳驗(yàn)證重組蛋白的酶學(xué)活性，結(jié)果如圖5所示。從木聚糖酶活性電泳看出，約35kD和約49kD處的蛋白均具有木聚糖酶活性，初步驗(yàn)證基因xyl-BH-G10所表達(dá)的蛋白及加了His標(biāo)簽的重組蛋白均具有木聚糖酶活性。進(jìn)一步使用DNS法測(cè)定木聚糖酶活性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 重組大腸桿菌和菌株HSL38木聚糖酶酶活力Table 2 Xylanase activities of recombinant E. coli and original HSL38 strain

從表2可以看出，在最佳誘導(dǎo)條件下，木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，酶活達(dá)到55.28U/mL，是原菌株HSL38發(fā)酵液酶活的4倍。

3 結(jié) 論

本研究從紅樹(shù)林土壤中篩選出具有木聚糖酶活性的耐堿性菌株HSL38，并根據(jù)已有數(shù)據(jù)庫(kù)資源克隆出該菌株的木聚糖酶基因xyl-BH-G10，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，酶活力達(dá)到55.28U/mL，是原菌株HSL38發(fā)酵液酶活力的4倍。通過(guò)對(duì)xyl-BH-G10基因進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)β-1,4-木聚糖酶基因xynA的同源性達(dá)到99%，蛋白序列一致。同時(shí)，通過(guò)蛋白電泳和活性電泳發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下，該基因在大腸桿菌中出現(xiàn)截?cái)啾磉_(dá)現(xiàn)象，但這不影響對(duì)基因功能的驗(yàn)證。根據(jù)梁艷麗等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，xynA基因表達(dá)的蛋白，在pH4.5～9.0的條件下均有酶活力。Nishimoto等[18]研究堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125的堿性木聚糖酶XynA發(fā)現(xiàn)其活性中心的不同的質(zhì)子供體氨基酸會(huì)影響到酶的pH值穩(wěn)定性。通過(guò)研究蛋白結(jié)構(gòu)探索不同來(lái)源木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，并且定向進(jìn)化木聚糖酶基因[19]，或者利用異源表達(dá)，構(gòu)建基因工程菌[20]，成為今后木聚糖酶研究的方向。

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Cloning and Expression of Xylanase Gene from Alkaliphilic Bacillus halodurans

CHEN Na，SHENG Ji-ping，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In this study, an alkaliphilic strain (HSL38) producing xylanase was isolated from mangrove soil, and identified as Bacillus halodurans C-125 (GenBank: NC_002570.2) based on 16S rDNA analysis, which revealed a similarity of 99%. Specific primers based on theβ-1,4-xylanase gene xynA of Bacillus halodurans C-125 were designed, and theβ-1,4-xylanase gene (xyl-BH-G10) from HSL38 strain was amplified. Sequence analysis showed 99% similarity between the xynA gene and the amplified gene encoding a precursor of 396 amino acid residues (45.27 kD), which belonged to glycoside hydrolase family 10 GH10. A recombinant expression plasmid was constructed by linking xyl-BH-G10 to the expression plasmid pET-30a-c(+), and then transformed into E. coli BL21(DE3). The expression of recombinant protein was achieved under IPTG induction. These investigations indicated that theβ-1,4-xylanase gene xyl-BH-G10 was highly expressed in E. coli BL21 (DE3) cells under the optimal induction conditions, and an xylanase activity of 55.28 U/mL was obtained, which exhibited a 4-fold enhancement when compared to the fermentation of original HSL38 strain.

Bacillus halodurans；xylanase；cloning；expression

Q786

A

1002-6630(2011)05-0234-05

2010-09-26

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(200803033)

陳娜(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：chenna0419@126.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，主要從事果蔬采后病理與農(nóng)副產(chǎn)品資源綜合利用研究。

E-mail：shen5000@gmail.com