四氯化碳復合法誘導家兔肝纖維化模型的建立

郭 秋，任 克

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，沈陽 110001)

四氯化碳復合法誘導家兔肝纖維化模型的建立

郭 秋，任 克

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，沈陽 110001)

目的 建立一組家兔肝纖維化動物模型，并總結建模過程中所得到的經(jīng)驗。方法 選用30只普通級家兔，隨機選取2～4只家兔作為實驗組，5只為對照組。飼養(yǎng)適應1周后，四氯化碳色拉油溶液以5%的起始濃度經(jīng)腹腔注射法注入實驗組家兔體內(nèi)，對照組給予相同劑量的生理鹽水。于造模4W、7W、10W、13W、16W末分別處死24只實驗組及1只對照組家兔，以觀察肝纖維化的發(fā)展程度。結果 造模期間實驗組家兔死亡7只，對照組家兔無死亡。家兔肝臟纖維化程度隨著造模時間延長而逐漸加重。結論 此方法成功地建立了一種兔肝纖維化動物模型。

肝纖維化;家兔;模型

肝纖維化進一步發(fā)展則為肝硬化，肝纖維化可以治療后逆轉，發(fā)展為肝硬化時則難以逆轉。因此，為深入研究肝纖維化的病因與發(fā)病機制，實現(xiàn)早期診斷，篩選防治肝纖維化的有效藥物，建立肝纖維化動物模型是十分必要的。利用CCL4法建立肝纖維化模型最關鍵的問題是藥物濃度以及給藥劑量較難掌握，本實驗成功的建立一組家兔肝纖維化模型，并在建?；A上總結了一些經(jīng)驗。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取5月齡普通級家兔30只(由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供［SCXK(遼)2008-0005］)，體重在2.5～3.0 kg，雌雄不限。將其隨機分為兩組：實驗組25只，對照組5只，分籠飼養(yǎng)，每籠一只家兔，顆粒料喂食，實驗組家兔給予10%乙醇水溶液為唯一飲用水，對照組家兔飲用自來水。室內(nèi)通風良好，溫度、濕度適宜。

1.2 動物模型建立

動物飼養(yǎng)適應一周后進行模型建立。實驗組：將四氯化碳(沈陽市新化試劑廠，純度99%)溶于無菌色拉油中搖勻，注射藥物的起始濃度為5%，按0.1 mL/kg劑量，采用腹腔注射的方式進行給藥，注意回抽注射器，以防止誤刺入血管及臟器內(nèi)致動物死亡。前兩周每周注射一次，第三周開始每隔三天注射一次。從第三周開始藥物濃度每兩次提高2%，注射劑量維持在(0.1～0.2 mL/kg)根據(jù)動物體重變化及飲食情況調(diào)整。對照組給予相同劑量生理鹽水。

1.3 病理組織學檢查

于造模4W、7W、10W、13W、16W 末時，經(jīng)耳緣靜脈注入空氣栓塞法分別處死2～4只實驗組家兔和1只對照組家兔，取出新鮮肝臟用福爾馬林溶液固定48 h后，分別于肝左外葉及肝右前葉切取組織塊，經(jīng)石蠟包埋，常規(guī)切片及HE染色。鏡下觀察肝臟匯管區(qū)、肝竇壁及中央靜脈等處的膠原纖維增生情況。肝纖維化程度評判采用Scheuer制定的肝纖維化分期評估方案［1］(S0～S4)：S0期為無纖維化;S1期為匯管區(qū)纖維化擴大，局限于竇周和小葉內(nèi)纖維化;S2期為匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留;S3期為纖維間隔形成伴小葉結構紊亂，無肝硬化;S4期為早期肝硬化。

2 結果

2.1 一般情況

造模期間實驗組家兔死亡7只，對照組無死亡，共23只家兔完成實驗，實驗組病死率為28%。實驗組家兔隨給藥時間延長，體重無明顯增加，甚至部分家兔體重略減輕，對照組家兔體重明顯增加。實驗組家兔在每次注射藥物后的前兩天內(nèi)精神萎靡，活動明顯減少，第3天狀態(tài)略恢復。對照組家兔無不良反應。

2.2 病理學檢查結果分析

大體觀察，見對照組家兔肝臟顏色鮮紅，表面光滑，質(zhì)地柔軟。實驗組家兔肝臟隨著注射藥物次數(shù)的增多，肝纖維化的程度逐漸加重，肝臟顏色略呈灰白色改變，表面凹凸不平，肝臟邊緣變頓，質(zhì)地較硬(圖1)。鏡下觀察，分別于40、100倍顯微鏡下觀察，HE染色結果顯示實驗組隨給藥時間延長，肝內(nèi)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維數(shù)量增多、范圍擴大，肝細胞變性、壞死及炎細胞浸潤逐漸加重(圖2)。還發(fā)現(xiàn)同一時期行病理學檢查的家兔肝纖維化程度并不完全相同，且同一家兔不同肝葉所形成肝纖維化程度也不完全相同(表1)。

表1 各次病理學檢查結果分期情況Tab.1 The results of various pathological conditions in phases

3 討論

本實驗選用家兔造模，一方面家兔性情溫和便于操作，另外家兔肝臟體積大小滿足于一般的實驗要求，例如進行CT或磁共振掃描等。且血容量相對較多，可以滿足一般化驗需要。CCL4造模法在形態(tài)學、病理生理學某些方面與人類肝纖維化相似，且該方法造模途徑多樣、簡便、費用低廉、病理特征穩(wěn)定可靠、復制時間短，廣泛應用于研究肝纖維化發(fā)生細胞、分子機制、血清學標志物與組織病理的相關性及抗纖維化物質(zhì)的藥效評價［2］，目前作為科研中肝纖維化造模的主要方法。

3.1 CCL4+乙醇復合法致肝纖維化的機制

CCL4進入動物體內(nèi)后，在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過肝微粒體細胞色素P450氧化酶激活后，產(chǎn)生三氯甲基自由基(CCL3·)，CCL3·與肝細胞內(nèi)大分子發(fā)生共價結合，破壞肝細胞功能。此外，CCL3·還可攻擊膜不飽和脂質(zhì)，引發(fā)活性氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，損傷肝細胞。CCL4進入體內(nèi)15 min即可引起肝細胞損害，至48 h達到高峰，隨后進入修復階段。間隔3～4 d給藥1次，即在肝損害后的修復期再次給藥，重復損害-修復-損害的過程，誘導肝纖維化形成［3～5］。

乙醇本身即為肝硬化的重要病因，成人日攝入量多于 30 g/d 可誘發(fā)肝硬化［6，7］，乙醇可刺激肝細胞脂肪合成，并誘導 P450活性，從而增加CCl4的肝毒性，加速肝細胞壞死［8～10］，乙醇與 CCL4聯(lián)合應用造模已有較多成功報道，兩者合用可以使造模時間縮短，且可減少兩者劑量以降低藥物副作用與動物的不耐受現(xiàn)象。

3.2 CCL4經(jīng)腹腔注射法的優(yōu)勢

將CCL4引入動物體內(nèi)的方法多種，如腹腔注射法、口服法、皮下注射或肌肉注射法、空氣吸入法［11］等，本實驗采用腹腔注射法的原因有：①避免因口服給藥受動物食欲影響而致劑量較難掌握，實驗終點不夠明確;②避免因肌肉注射或皮下注射而易發(fā)生浸潤性膿腫;③由于CCL4具有高揮發(fā)性，避免因空氣吸入法造成的環(huán)境污染。

3.3 給藥方法的總結

CCL4法建立肝纖維化模型的缺點是動物個體差異較大，CCL4肝毒作用迅速劇烈，劑量掌握不當時動物死亡率高，停止造模給藥后，有自然恢復的趨勢。本實驗過程中，實驗組家兔共死亡7只。其中，造模前5周內(nèi)，實驗組家兔死亡5只，表現(xiàn)多伴有口鼻血色或白色泡沫溢出，其中可見一只家兔全身皮膚紫黑色，經(jīng)過尸檢后可見肝臟腫大、紫黑色，肝表面可見點狀白色膜狀物，考慮多由急性CCl4中毒引起肝壞死，釋放出凝血活酶樣物質(zhì)，引起血管內(nèi)皮損害，導致嚴重出血有關［12］。7周時死亡 1只，死亡原因為自發(fā)性肝臟轉移瘤形成，家兔惡病質(zhì)而死。9周時死亡1只，死亡原因為家兔雙側后爪感染面積較大，未能治愈影響全身狀態(tài)而死。

從第3周起的前兩周內(nèi)，每周注射藥物兩次，且每次藥物濃度較前一次提高2%，如此注射藥物持續(xù)兩周，實驗組家兔死亡4只，考慮藥物濃度提高速度較快，家兔難以耐受，因此，于第五周開始，每周兩次注射藥物濃度保持不變，即每注射兩次藥物濃度提高2%，使其產(chǎn)生耐受過程，按此方法后實驗組家兔死亡率明顯降低。因此，給藥濃度與給藥時間間隔的變化對降低動物的死亡率至關重要。

3.4 本實驗病理結果分析

病理檢查結果顯示，肝左外側葉與肝右前葉所取部位的肝纖維化程度不盡相同，但并不能依此推斷出哪個肝葉纖維化程度更重，且兩肝葉纖維化程度相差并不十分顯著，多為一個分期間隔，考慮其原因可能為：①家兔肝臟各葉供血及回流血管分布不同，毒性藥物主要經(jīng)門靜脈吸收回流入血，因而可能造成一定差異;②樣本數(shù)量有限，未能充分體現(xiàn)出不同肝葉纖維化程度之間的差異;③取材范圍有限，且肝纖維化多為不均勻性分布。同一時期處死家兔肝臟病理檢查結果提示，其肝纖維化形成的程度并不完全相同，考慮可能由于家兔個體差異所致。

家兔肝纖維化模型建立方法相對較復雜，研究要以尋求CCL4使用的最佳途徑、劑量、復合因素的搭配及降低死亡率為重點。本研究采用初始低濃度、低劑量，逐漸遞增法建立兔肝纖維化動物模型，實驗結果表明這種方法值得在今后的應用中推廣。

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Establishment of Hepatic Fibrosis in Rabbit Model by Injecting Carbon Tetrachloride and Drinking Ethanol Water

GUO Qiu，REN Ke
(Department of Radiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China)

Objective To establish a set of rabbit model of hepatic fibrosis，and summarize the experiences from the modeling process.Method 30 normal level rabbits were divided into two groups，25 rabbits as the experimental group were given carbon tetrachloride and oil mixture by intraperitoneal injection;five rabbits of the control group were given the same dose of saline.At 4th、7th、10th、13th、16th Week ，2 ～ 4 rabbits from the experimental group and 1 from the control group were sacrificed to observe the degree of hepatic fibrosis.Result During the modeling，seven rabbits of the experimental group were dead;the entire control group was survived.The degree of hepatic fibrosis was aggravated gradually with modeling extended.Conclusion The method successfully established a set of rabbit model of hepatic fibrosis.

Hepatic Fibrosis;Rabbit;Model

R-33 R332

A

1671-7856(2011)03-0036-03

2010-08-18

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.009

郭秋(1983-)，研究方向：腹部影像診斷學/磁共振功能成像在肝纖維化疾病診斷中的應用。

任克，研究方向：腹部影像診斷學與分子影像學。