董 峰，郭紅云，張永東，梅 澍

(1.甘肅省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，蘭州 730050;2甘肅省醫(yī)學科學研究院藥理毒理研究中心，蘭州 730050)

溫敏型殼聚糖介入核素188Re內(nèi)照射抗小鼠移植性肝癌(H22)

董 峰1，郭紅云2，張永東2，梅 澍1

(1.甘肅省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，蘭州 730050;2甘肅省醫(yī)學科學研究院藥理毒理研究中心，蘭州 730050)

目的 研究溫敏型殼聚糖(chitonsan CS)介入核素188Re內(nèi)照射對小鼠移植性肝癌(H22)的抑制作用。方法 建立小鼠肝癌(H22)模型后隨機分成7組，即模型對照組、188Re(0.1mCi)組、188Re-S(0.1mCi)組、188Re+CS(0.1mCi)組、188Re+CS(0.2mCi)組、188Re+硫膠體 +殼聚糖(188Re-S+CS 0.1mCi)組和188Re-S+CS(0.2mCi)組。各組動物瘤內(nèi)分別注射相應試藥，測定腫瘤抑制率。結果188Re+CS組和188Re-S+CS組腫瘤生長速度減慢，腫瘤生長延遲，腫瘤抑制率在治療后6 d最高，抑制率分別為67.35%和67.81%。結論 溫敏型殼聚糖介入核素188Re內(nèi)照射對小鼠肝癌(H22)具有一定的抑制作用。

188Re;溫敏型殼聚糖;內(nèi)照射;H22;抗腫瘤

核醫(yī)學可以利用某些放射性藥物中標記核素的特殊物理性質(zhì)，在對多種腫瘤及其轉移病灶進行顯像的同時實施內(nèi)照射治療，這一獨特的腫瘤診療方法在臨床中已日益受到人們的重視。188Re(錸，rhenium)是一種新型理想的治療用放射性核素藥物，半衰期為16.9 h，能發(fā)射最大能量2.12 MeV的β-射線，其輻射作用一方面可直接引起生物大分子的損傷導致細胞凋亡，另一方面還可電離水分子，產(chǎn)生過氧化氫等氧自由基，間接加速細胞凋亡［1～3］。應用188Re標記物進行腫瘤介入治療，可以通過腫瘤供血動脈進行阻塞血管和核素內(nèi)照射的雙重作用達到治療的目的。因而，188Re優(yōu)良的理化性質(zhì)在腫瘤的診斷和治療領域倍受關注。如何提高放射性核素在腫瘤體內(nèi)的滯留率，降低體內(nèi)的分布是腫瘤核醫(yī)學的重點研究課題之一。

智能水凝膠作為一種智能材料在生物化學和生物醫(yī)學領域吸引了相當?shù)年P注，它能感應環(huán)境的變化同時本身會從收縮狀態(tài)變?yōu)槿苊洜顟B(tài)，具備了感應功能和受動功能［4］。在智能水凝膠的系列中，殼聚糖作為溫敏在體凝膠，在生物給藥系統(tǒng)中的應用近年來日益受到藥劑學研究者的重視。殼聚糖是甲殼素的脫乙酰衍生物，是一種生物相容的pH敏感型陽離子聚合物，在pH6.2以下能溶解于水，pH6.2以上會形成凝膠［5］。為防止腫瘤手術切除部位復發(fā)，Gariépy 等［6］用殼聚糖作為載體，將疏水性抗癌藥物紫杉醇進行局部輸送，結果顯示，對于抑制小鼠EMT-6癌細胞的生長，注射1次溫敏性凝膠制劑與4次靜脈注射商品注射劑Taxol產(chǎn)生的效果一樣，且毒副作用更小。本課題利用醫(yī)用智能水凝膠溫敏型殼聚糖作為載體介入核素188Re，置入腫瘤部位，在局部形成高活度放射性聚集區(qū)，起到靶向治療腫瘤的效果，放射性衰變的同時作為載體的智能水凝膠溫敏型殼聚糖在人體內(nèi)定時降解，可減少全身用量，降低毒副作用。

1 材料和方法

1.1 試劑

硫膠體(S)、放射性核素188Re由中國科學院上海應用物理研究院提供鎢-錸發(fā)生器，188Re-硫膠體(188Re-S)按照使用操作說明書由本院核醫(yī)學制備。殼聚糖(CS)：脫乙酰度為95.9%，由浙江金殼生物化學有限公司生產(chǎn)。批號：20060214。β-甘油磷酸鈉(β-GP)，F(xiàn)luka公司生產(chǎn)。鹽酸：白銀良友化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號：051130。

1.2 儀器

GC-1200γ放免儀器，CRC-15R放射性活度測量儀、202-2電熱干燥箱，JA-2003型電子天平，PYXDHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，SHZ-82氣浴恒溫振蕩器。

1.3 動物

昆明種小鼠，購自甘肅省醫(yī)學科學研究院實驗動物中心，體重 20±2 g，雌雄兼有［SCXK(甘)2006-0010］。

1.4 瘤株

小鼠肝癌H22，由中國科學院北京藥物研究所購買，本所藥理毒理實驗中心傳代保種。

1.5 殼聚糖介入核素188Re凝膠的制備

將殼聚糖800 mg溶于18 mL，0.2 mol/L鹽酸中充分攪拌。取所需放射性活度的188Re或188Re-S溶液與等體積殼聚糖溶液充分攪拌。稱取β-GP 1500 mg溶于2 mL去離子水中充分溶解，將β-GP溶液滴加至所得殼聚糖溶液中，置4℃冰箱中15 min，備用。

1.6 腫瘤接種和分組及給藥方法

無菌條件下抽取小鼠腹水瘤液，用生理鹽水稀釋成1×107/mL的瘤細胞懸液，于每只小鼠右前肢皮下接種0.2 mL。接種7～8 d時選瘤體生長良好、瘤體平均直徑為1.0～1.5 cm的小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，分別為模型對照組 A及188Re(0.1mCi)B組、188Re-S(0.1mCi)C組、188Re+CS(0.1mCi)D組 (188Re+殼聚糖)、188Re+CS(0.2mCi)E組、188Re-S+CS(0.1mCi)F組(188Re+硫膠體+殼聚糖)、188Re-S+CS(0.2mCi)G組。將B、C組小鼠瘤內(nèi)中心分別注射 0.2 mL188Re或188Re-S溶液;D、E、F、G組小鼠瘤內(nèi)中心分別注射0.2 mL的殼聚糖介入核素188Re凝膠;模型組注射等容積生理鹽水。

1.7 觀察指標

給藥后每隔1天用游標卡尺測量瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積 =0.5×長徑×短徑。腫瘤抑制率：(對照組腫瘤體積—治療組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。當治療后腫瘤體積與治療前腫瘤體積為某一值時，治療組所需天數(shù)與對照組所需天數(shù)的差值為腫瘤生長延遲(tumour growth delay)時間。本研究觀察腫瘤體積達治療前體積5倍和8倍時的延遲天數(shù)。對腫瘤生長曲線進行擬合后，求出腫瘤體積達到治療前體積的5倍和8倍時所需的生長時間，治療組與對照組生長時間的差值為腫瘤生長延遲時間。分別于給藥后7 d、14 d取各組動物腫瘤用2%戊二醛固定，樹脂包埋，超薄切片，檸檬酸鉛染色，電子顯微鏡觀察。用8%甲醛中固定，常規(guī)制片，進行病理組織學檢查。

1.8 所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，應用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，多組均數(shù)比較用單因素方差分析。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 殼聚糖介入核素188Re對 H22腫瘤生長的延遲效應

表1可見，各治療組治療后腫瘤體積達到治療前5倍，較模型組均可使腫瘤生長延遲，其中188Re+CS(0.1mCi)組和188Re+CS(0.2mCi)組分別為3.03 d和3.13 d;188Re-S+CS(0.1mCi)組和188Re-S+CS(0.2mCi)組分別為3.08 d和3.31 d，單用188Re和88Re-S組腫瘤生長延遲較短，分別為1.09 d和1.57 d。各治療組治療后腫瘤體積達到治療前8倍時，腫瘤生長延遲分別為：188Re+CS(0.1mCi)組和188Re+CS(0.2mCi)組為2.08 d和2.20 d;188Re-S+CS(0.1mCi)組和188Re-S+CS(0.2mCi)組為2.26 d和2.73 d，單用188Re和88Re-S組腫瘤生長延遲較短，分別為0.73 d和1.06 d。

表1 殼聚糖介入核素188Re治療H22肝癌后各組腫瘤生長延遲時間 (d)Tab.1 The delay time of tumor growth after therapy of interventional radionuclide188Re in thermosensitive chitosan on H22cancer (d)

2.2 殼聚糖介入核素188Re對 H22腫瘤生長的抑制作用

給藥9 d后各組動物因有死亡，腫瘤體積不能進行統(tǒng)計。模型組瘤體積起始為(0.453±0.064)cm3，給藥 2 d、4 d、6 d、8 d 分別為(1.045 ±0.322)cm3、(2.818 ± 0.898)cm3、(4.704 ± 1.036)cm3，而188Re，1S188Re+CS小劑量組，188Re+CS大劑量組，88Re-S，188Re-S+CS 小劑量組，188Re-S+CS 大劑量組各給藥組腫瘤體積在2 d分別為(0.633±0.102)～(0.882±0.178)cm3之間，4 d分別為(1.172±0.461)～(1.842±0.386)cm3之間，6 d分別為(1.514±0.634)～3.537±1.935)cm3之間;8 d分別為(3.500±0.857)～6.892±2.820)cm3之間，各組 2 d、4 d、6 d、8 d 腫瘤抑制率見表 2：

表2 殼聚糖介入核素188Re對 H22腫瘤生長的抑制率Tab.2 The tumor inhibitory rate of interventional radionuclide188Re in thermosensitive chitosan on H22 cancer

殼聚糖介入188Re或188Re-S組瘤體積與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);188Re+CS大、小劑量組瘤體積與188Re組比較有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);，188Re-S+CS大、小劑量組瘤體積與188Re-S組比較，也有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。表明188Re殼聚糖藥物載體凝膠對動物移植性腫瘤肝癌H22具有明顯的抑制作用。

2.3 HE染色后光鏡觀察

模型組：瘤細胞生長旺盛，細胞體積，核染色深大小不一，病理核分裂相較多，脂肪和橫紋肌組織內(nèi)有很多浸潤生長的腫瘤細胞。腫瘤內(nèi)新生微血管豐富(彩插2圖1～2)。

治療組：瘤組織生長局限，瘤細胞體積變小，瘤細胞排列規(guī)則，生長稀疏，微血管較少，壞死區(qū)由瘤組織外周向中心漸進。其內(nèi)見脂肪組織，瘤細胞巢及巢間有壞死，間質(zhì)內(nèi)和瘤周有較多淋巴細胞。瘤周和間質(zhì)內(nèi)有許多淋巴細胞浸潤(彩插2圖3～4)。

2.4 電鏡觀察

給予放射性核素188Re-S+CS小劑量組通過電鏡掃描結果均可見腫瘤組織細胞凋亡小體，見核染色質(zhì)固縮凝結，形成高點子密度的斑塊，呈新月形積聚在核膜周邊(彩插2圖5～6)。

3 討論

本實驗通過醫(yī)用高分子材料-殼聚糖介入放射性核素188Re在腫瘤局部注射，以達到提高核素在腫瘤病灶內(nèi)局部有效滯留之目的。188Re是近年來推出的新的用于腫瘤治療放射性核素藥物，其半衰期為16.9 h，通過 β-衰變到穩(wěn)定的188Os，分別以 79% 和20%的幾率發(fā)射最大能量為2.12 MeV和1.97 MeV的 β 射線［7］。188Re-硫化錸膠體(sulphur colloid)最早被用于關節(jié)增生滑膜的切除治療。實驗證實，腫瘤內(nèi)注射大顆粒放射性物質(zhì)可直接并最大限度地對靶器官產(chǎn)生電離輻射，減少對正常組織的輻射［8］。溫敏型殼聚糖是一種聚陽離子的生物二聚體，主要通過對幾丁質(zhì)脫乙?；@得。而幾丁質(zhì)則主要來自蝦、蟹的外殼［9］。在室溫和低于室溫時可長期保持液體狀態(tài)，具有很高的流動性。注入體內(nèi)后，在體溫下發(fā)生凝膠化，具有良好的的組織相容性、生物可降解性和黏附性，可使藥物駐留于病灶，隨著凝膠的降解而緩慢慢釋放，很適合在醫(yī)學、生物學領域得到了深入的研究和廣泛的應用［10］。

本研究結果表明：188Re及其殼聚糖藥物載體凝膠對動物移植性腫瘤肝癌H22均具有一定的抑制作用。殼聚糖介入核素188Re或188Re-S作用較單用188Re或188Re-S作用顯著，表明糖介入核素188Re或188Re-S，當注射至腫瘤內(nèi)后，即在短時間內(nèi)發(fā)生凝膠化，使188Re固定在腫瘤內(nèi)部，直接作用于腫瘤細胞，增強了抗腫瘤效果。其中188Re-S+CS大劑量組抑制率最高，抑制率達67.81%。188Re殼聚糖藥物載體凝膠瘤內(nèi)注射后，觀察腫瘤的治療效應。在處理后觀察的8 d內(nèi)，各治療組腫瘤生長速度減慢，腫瘤生長延遲，腫瘤抑制率在治療后6 d最高，8 d時腫瘤生長速度加快，提示核素治療的次數(shù)還應增加。

以放射免疫治療(RIT)為代表放射性核素內(nèi)照射治療腫瘤的研究是近年來關注熱點，國內(nèi)外學者研究表明，大劑量的 RIT實體瘤療效并不理想，將RIT用于小病灶實體瘤或?qū)嶓w瘤的微小轉移灶［11］。多次小劑量給藥能增加腫瘤部位放射性攝取、機體的免疫興奮效應，誘導腫瘤凋亡與老化［12］。88Re殼聚糖藥物載體凝膠能夠延長荷H22腫瘤小鼠生存時間，提高生命延長率。其中小劑量組188Re+CS小鼠生存時間最長，為 33.4±11.4 d，生命延長率達108.00%。關于低劑量核素內(nèi)照射治療的機體免疫興奮效應的作用和機理有待于進一步的探索研究。

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Invistagation of antitumor efffect of internal Irradiation of Interventional Radionuclide188Re in Thermosensitive Chitosan on Mouse Transplanted Tumor H22

DONG Feng1，GUO Hong-yun2，ZHANG Yong-dong2，MEI Shu1
(1.Department of Nuclear Medicine，Gansu Academy of Medical Sciences，Lanzhou 730050，China 2.China Pharmacology＆ Toxicology Experiment Center，Gansu Academy of Medical Sciences，Lanzhou 730050，China)

Objectives To study the inhibitory activity of internal irradiation of interventional radionuclide188Re in thermosensitive chitosan on mouse transplanted tumor H22(liver cancer).Method The tumor-bearing mice were divided into 7 groups randomly，including model control，188Re(0.1mCi)group，188Re-S(0.1mCi)group，188Re+CS(0.1mCi)group，188Re+CS(0.2mCi)group，188Re-S+CS 0.1mCi)and188Re-S+CS(0.2mCi)group.The mice tumor was injected with corresponding reagent respectively，and the inhibitoy rate of tumor was observed after administrated.Results The growth of tumors in188Re+CS group and188Re-S+CS group was slowed.the tumor inhibitory rate reached the highest level after 6 days therapy，which respectively was 67.35% and 67.81%.Conclusions Internal irradiation of interventional radionuclide188Re in thermosensitive chitosan had the effect of inhibitory mice liver cancer.

188Re;Thermosensitive Chitosan;Internal irradiation;H22;Antitumor

R817.91 R332

A

1671-7856(2011)03-0014-04

2010-08-04

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.004

2004年度《西部之光》資助項目;甘肅省科學事業(yè)項目(QS-041-C33-37)。

董峰(1957-)男，主任醫(yī)師，研究方向，腫瘤分子核醫(yī)學。E-mail.donfeng@hotmail.com。