王飛，農(nóng)云軍，蘇流坤，竇文淵，石燕麗

（中國廣州分析測試中心廣東省化學危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣州510070）

高效液相色譜法測定奶粉中卵磷脂的質(zhì)量分數(shù)

王飛，農(nóng)云軍，蘇流坤，竇文淵，石燕麗

（中國廣州分析測試中心廣東省化學危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣州510070）

建立了奶粉中卵磷脂（PC）的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測的測定方法，奶粉經(jīng)去蛋白-液液萃取-富集濃縮超濾后進高效液相色譜儀，采用硅膠色譜柱，正己烷-異丙醇-水(體積比31∶62︰7)流動相體系，等度洗脫能夠快速有效地分離奶粉中的卵磷脂。線性范圍為0.020～1.60 g/L,相關(guān)系數(shù)為0.9996,檢出限為15 mg/L,加標回收率為95.2%～96.8%。該方法用于實際樣品的測定，結(jié)果令人滿意。

高效液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測；奶制品；卵磷脂

0 引言

磷脂酰膽堿（PC）俗稱卵磷脂，具有重要的生理功能和乳化性能，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和醫(yī)藥等行業(yè)[1]。在奶粉行業(yè)中，卵磷脂作為一種乳化劑，被噴涂在奶粉表面可顯著增強其親水性，增加奶粉的分散性，達到速溶的目的，同時卵磷脂又起到了營養(yǎng)保健的作用。但是卵磷脂作為一種食品添加劑，噴涂于奶粉中時一般允許添加量小于0.4%[1]，所以建立一種快速、靈敏、有效的測定奶粉中卵磷脂含量的方法在保障食品安全方面有重要意義。

目前卵磷脂的檢測方法主要有分光光度法[2-4]、薄層色譜法[5，6]、熒光分光光度法[7]、核磁共振法[8]和高效液相色譜法[9-11]等。近年來，對保健品中卵磷脂的分析研究報道較多，但對于奶粉中卵磷脂的測定還沒有國家標準，文獻報道的只有分光光度法[2]，步驟繁瑣復雜。本文建立了奶粉中卵磷脂含量的高效液相色譜測定法,可以滿足實際樣品分析的要求，為從事食品安全檢測人員提供了一定的參考信息，為制定統(tǒng)一的檢測標準提供了方法學基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 儀器和試劑

LC-20A液相色譜儀（包括二元梯度泵，自動進樣器、控溫箱、控制系統(tǒng)）；Alltech-2000蒸發(fā)光散射檢測器；島津LC solution色譜工作站。磷脂酰膽堿、蛋白酶、正己烷、異丙醇均為色譜純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱:UltimateTMSiO(4.6×250 mm,2.5 μm)；流動相：正己烷-異丙醇-水(體積比31∶62∶7)，柱溫為35℃；流速為1.0 mL/min。蒸發(fā)光散射檢測器氮氣流速2.6 L/min,漂移管溫度80℃。

1.3 標準溶液的配制

磷脂酰膽堿標準儲備液:準確稱取磷脂酰膽堿50 mg,置于25 mL容量瓶,用正己烷-異丙醇（體積比為1︰1）超聲溶解定容，配置成質(zhì)量濃度為2.00 g/L的標準儲備液。

磷脂酰膽堿標準工作液：取標準儲備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，5.0，6.0 mL分別用正己烷-異丙醇（體積比為1︰1）稀釋至10 mL,配置成質(zhì)量濃度為20，40，80，160，320，640，1000，1200 mg/L系列標準工作溶液。

1.4 樣品處理

精密稱取樣品10.0 g，加入適量水溶解，再加入蛋白酶除去蛋白，過濾，濾液置于分液漏斗中，用正己烷萃取3次，合并濾液和洗液，減壓蒸餾正己烷至干，殘渣用正己烷-異丙醇（體積比為1︰1）溶解定容5.00 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取純化和富集

奶粉成分十分復雜，如果不進行提取純化，會很大程度地干擾結(jié)果的測定，因此我們必須要把樣品的前處理做好，才能保證卵磷脂被有效地分離。經(jīng)過多次實驗，分析得到的譜圖，最終確定樣品先用適量的蛋白酶去除蛋白，離心過濾后得到的上清液再用正己烷萃取3次，合并濾液和洗液，再減壓蒸餾進行濃縮，最后殘渣用正己烷-異丙醇（體積比為1︰1）溶解定容5.00 mL。

2.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

卵磷脂的紫外吸收比較弱，用紫外檢測器在205 nm波長下檢測干擾物質(zhì)多，結(jié)果不穩(wěn)定。本文采用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）這種質(zhì)量型檢測器，其響應(yīng)取決于被分析質(zhì)粒的數(shù)量和大小，在不含共軛結(jié)構(gòu)或無紫外吸收物質(zhì)的分析中具有相當?shù)膬?yōu)勢，避免了卵磷脂用紫外檢測僅限于極短波長處干擾物質(zhì)大的缺陷。根據(jù)實驗室的實際情況，反復摸索實驗條件最終確定采用正相色譜柱，以正己烷-異丙醇-水體系作為流動相，溶劑背景噪聲最低。

圖1 卵磷脂高效液相色譜

改變流動相體系中正己烷和異丙醇的比例，對卵磷脂的峰形和出峰時間都有一定的影響，加大異丙醇的比例可以改善峰形，但卻延長了分析時間，結(jié)果表明，采用正己烷-異丙醇的體積比為31︰62時最為合適。流動相體系中水的加入量主要影響卵磷脂的出峰時間，增加水的加入量，則使卵磷脂出峰時間加快。但是若卵磷脂出峰時間太快，目標峰和雜質(zhì)的分離度會降低，不利于定量分析。實驗結(jié)果表明，正己烷-異丙醇-水的體積比為31∶62︰7效果最好，色譜峰對稱性好，保留時間適中，適用于定量分析（見圖1）。

2.3 線性范圍和檢出限

取不同濃度的標準品溶液，在選定的色譜條件下測定，以峰面積S的對數(shù)為縱坐標，進樣質(zhì)量M的對數(shù)為橫坐標作圖，得線性回歸方程為ln S=9.679+1.551ln M,相關(guān)系數(shù)r為0.9996。線性范圍為0.020～1.60 g/L,檢出限為15 mg/L（S/N=3）。

2.4 精密度實驗

用質(zhì)量濃度為1.00 g/L的卵磷脂標準溶液，進樣10 μL，連續(xù)進樣6針，保留時間和峰面積的相對標準偏差分別為0.15%和1.12%。

2.5 平行性實驗

按照“1.4”方法處理方法，取某品牌奶粉均勻取樣6份，按照上述色譜測定條件對其中的卵磷脂含量進行測定，結(jié)果如表1，相對標準偏差（RSD）為0.93%。

表1 平行性實驗結(jié)果

2.6 回收率實驗

取適量含卵磷脂的奶粉樣品，在最佳的實驗條件下，按照“1.4”方法處理樣品，同時按加入本底平均值50%～150%的標準品做回收率實驗，結(jié)果如表2。

表2 回收率測定結(jié)果（n=5）

3 結(jié)論

本文采用HPLC-ELSD方法測定奶粉中卵磷脂的質(zhì)量分數(shù)，并按照方法學要求對方法的線性范圍、檢出限、精密度、重現(xiàn)性以及加標回收率等參數(shù)進行了確定。該方法分析時間短（約20 min），靈敏度高，該方法用于實際樣品的測定，結(jié)果令人滿意,為從事食品安全檢測人員提供了一定的參考信息，在保障食品安全方面有著重要的意義。

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[3] 劉偉娟，張均媚，薛剛.乳粉中卵磷脂含量的測定[J].食品研究與開發(fā),2005，26（1）：139-140.

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Determination of milk-powder Phosphatidycholine by high performance liquid chromatography

WANG Fei,NONG Yun-jun,SU Liu-kun,DOU Wen-yuan,SHI Yan-li
(Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangzhou 510070,China)

A method for the determination of milk-powder Phosphatidycholine（PC）by HPLC-ELSD was developed.PC in milk-powder was successfully separated on a SiO chromatography column,using hexane-isopropanol-water(31∶62∶7,v/v/v)as mobile phase after disposing protein,liquid-liquid extraction and concentration.The linear detection range was 0.020～1.60 g/L(r=0.9996)and the limit of detection(LOD)was 15 mg/L.The recovery was in the range of 95.2%～96.8%.The results of the actual sample indicated the method was accurate and reproducible.

high performance liquid chromatography;evaporative light scatter detector;milk-powder;phosphatidycholine

TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0053-03

2010-11-08

廣東省自然科學基金資助項目(7300055)。

王飛(1979-)，女，助理研究員，從事食品與環(huán)境分析檢測。