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      聚羥基烷酸酯的生物合成研究進展

      2011-10-19 03:34:50黃錦標尚龍安
      化工進展 2011年9期
      關鍵詞:輔酶戊酸丁酸

      黃錦標,尚龍安

      (1浙江大學化學工程與生物工程學系,浙江 杭州 310027;2浙江大學寧波理工學院,浙江 寧波 315100)

      進展與述評

      聚羥基烷酸酯的生物合成研究進展

      黃錦標1,尚龍安2

      (1浙江大學化學工程與生物工程學系,浙江 杭州 310027;2浙江大學寧波理工學院,浙江 寧波 315100)

      聚羥基烷酸酯(PHA)是一類在眾多微生物細胞內(nèi)可合成的聚酯,由于其可完全生物降解,是一類可替代傳統(tǒng)塑料的新型生物材料。該類聚酯在不同的微生物細胞內(nèi)的生物合成途徑已經(jīng)被廣泛和深入地研究。為降低其生產(chǎn)成本,實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),篩選更高產(chǎn)的菌株和利用廉價碳源來合成PHA成為近年來的研究重點。本文介紹了PHA的在微生物細胞內(nèi)的合成途徑以及最近幾年來生物合成PHA的研究進展。

      聚羥基烷酸酯;生物合成;生物可降解塑料;廉價碳源

      聚羥基烷酸酯(PHA)是可由眾多微生物在碳源充足而其它營養(yǎng)元素(如硫、磷、氮等)缺乏條件下作為碳源和能源的儲藏物質(zhì)在細胞質(zhì)內(nèi)合成的一類聚酯[1]。PHA結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。

      圖1 PHA的結(jié)構(gòu)通式

      圖1中,m=1、2、3,m為1最為常見,n可以為數(shù)百到數(shù)千不等。R為可變基團。當m=1,R為 CH3時即為常見的均聚物聚羥基丁酸酯(PHB)。

      由于PHA是由微生物胞內(nèi)合成的聚合物,PHA在自然條件下可完全生物降解。有氧條件下,PHA能完全降解成水和CO2。在厭氧條件下,能被微生物降解生成甲烷。PHA也具有傳統(tǒng)塑料的性質(zhì),如均聚物PHB同樣可以擠壓成型,制造膠片和與其它聚合物交聯(lián)生成共聚物。另外,PHA具有良好的生物相容性,在醫(yī)學領域也具有廣泛的應用,其水解得到的手性聚羥基烷酸廣泛應用于醫(yī)藥工業(yè)中手性藥物合成的起始原料[2]。

      該類聚酯作為一種可替代傳統(tǒng)塑料的新型材料已被國內(nèi)外學者廣泛研究,國內(nèi)的研究主要集中在利用基因修飾合成 PHA[3-5]以及利用活性污泥合成PHA[6-7],對PHA在微生物細胞內(nèi)的生物合成途徑和合成PHA的酶的研究沒有相關報道。本文介紹了PHA生物合成過程中的相關酶、在微生物細胞內(nèi)的合成途徑以及近年來 PHA的合成研究進展。

      1 PHA合成酶

      大多數(shù) PHA合成途徑相關酶的基因都集中在一個操縱子結(jié)構(gòu)中(圖2)。其中PhaC為編碼聚合酶,PhaA為編碼硫解酶,PhaB為編碼還原酶。此外在操縱子附近還有編碼凝聚蛋白的PhaP[8]、解聚酶PhaZ[9]、調(diào)節(jié)酶PhaR的基因[10-11]。在聚合物聚羥基丁酸酯PHB合成過程中,硫解酶和還原酶合成起始羥基丁酰輔酶A(HBCoA)單體,聚合酶催化HBCoA單體聚合生成PHB。

      目前,已發(fā)現(xiàn)四類PHA合成酶。從R.eutropha和A.vinosum分離純化得到的分別為Ⅰ型和Ⅲ型合成酶,該兩類酶以HBCoA為底物合成短鏈PHASCL且具有相似的生物催化過程(圖3)。第三種純化得到的PHA合成酶為Ⅱ型,該類酶以中長鏈3-羥基脂肪酸為底物(R=C3H7~C13H27,圖 1)合成中長鏈的PHAMCL[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),Ⅱ型合成酶相對于Ⅰ型和Ⅲ型合成酶轉(zhuǎn)換數(shù)非常低。在B. megaterium和Bacillus sp.INT005中分離得到的PHA合成酶為Ⅳ型合成酶,該類酶催化合成短鏈PHASCL[14-15]。不同類型的合成酶催化不同的底物且具有不同的次級單位(表1)。

      Ⅰ型和Ⅲ型合成酶催化機制和脂肪酶的催化機制很相似,脂肪酶結(jié)合在膠束狀三酰甘油表面上,通過表面和共價催化三酰甘油來水解脂肪酸(圖4),脂肪酶的水解催化反應(圖5)需要有絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的參與[16]。三酰甘油膠束和PHB在細胞內(nèi)的儲存形式非常相似,都是表面覆蓋有一層蛋白的顆粒狀物質(zhì),目前人們認為PHB合成酶與脂肪酶具有相似的催化動力學模型。Ⅱ型合成酶的研究尚處在起始階段,對其催化機制和蛋白結(jié)構(gòu)的了解有待進一步研究。

      圖2 R.eutropha Ⅰ型合成酶和A.vinosumⅢ型合成酶操縱子結(jié)構(gòu)

      圖3 Ⅰ型和Ⅲ型合成酶催化乙酰輔酶A合成PHB

      表1 合成酶類型與其對應合成聚合物種類

      圖4 脂肪酶與三酰甘油束表面作用示意圖

      圖5 脂肪酶催化三酰甘油的表面催化機理圖

      為更深入的了解PHA合成機理,對PHA合成酶的蛋白質(zhì)組學,合成酶的三級、四級結(jié)構(gòu)和PHA合成反應動力學的研究成為未來主題。Nikodinovic-Runic等[17]初步探索研究了Pseudomonas putidaCA-3在氮元素限制條件下利用苯乙烯作為唯一碳源合成中長鏈 PHA的蛋白質(zhì)組學,對比研究了在氮元素限制和氮元素充足的條件下 PHA生物合成相關的蛋白酶合成情況。Jia等[18-19]也對PHB在細胞內(nèi)的催化合成機制進行了比較深入的研究??梢灶A知,隨著對 PHA合成酶的深入研究,操縱PHA合成相關酶以便更有效的合成含有特定單體或者具有理想物化性能的PHA將成為可能。

      2 PHA生物合成途徑

      培養(yǎng)基碳源的種類可影響微生物細胞內(nèi)合成的 PHA鏈單體組成,因此可把培養(yǎng)基中的碳源分為相關碳源和非相關碳源。微生物在相關碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,細胞合成的PHA中的單體結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)基中碳源分子結(jié)構(gòu)相同,在非相關碳源培養(yǎng)基中合成 PHA鏈的單體與培養(yǎng)基中的碳源分子結(jié)構(gòu)不同。

      2.1 從非相關碳源合成短鏈PHASCL途徑

      葡萄糖在細胞中一般是通過糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸。在有氧條件下,丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A繼而進入三羧酸循環(huán)。Taguchi等[20]發(fā)現(xiàn)了從非相關碳源合成特殊 PHA,即聚乳酸-3羥基丁酸酯(poly[lactide-co-3-hydroxybutyrate])的合成途徑(圖6 A)。丙酮酸由丙酮酸脫氫酶(LDH)催化生成乳酸,隨后丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶催化乳酸轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A。Taguchi等用特殊改良過的PHA合成酶以乳酰輔酶A和從PhaA B途徑(圖6 B)得到的PHB為底物合成該共聚物。根據(jù)以前的研究,乳酰輔酶 A在細胞內(nèi)的合成量非常有限,很難整合到PHA聚合物中[21]。因此 Taguchi等的發(fā)現(xiàn)在 PHA的合成領域具有重要意義。

      圖6路線B為人們熟知的合成PHB的途徑。酮硫解酶(PhaA)催化兩分子的乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶 A,隨后被還原酶(PhaB)催化合成R-3-羥基丁酰輔酶A,最后PHA合成酶催化R-3-羥基丁酰輔酶A合成PHB。

      圖6路線C為通過脂肪酸合成途徑合成PHB。乙酰輔酶A脫羧酶(AccA)催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A,經(jīng)由丙二酰輔酶A:ACP酰基轉(zhuǎn)移酶(FabD)催化,丙二酰輔酶A生成丙二酰-ACP復合物,再由3-酮酯酰-ACP合成酶Ⅲ(FabH)催化合成乙酰乙酰輔酶A,最后由3-酮酰-ACP還原酶(FabG)和PHA合成酶合成PHB。原生型的FabH蛋白的轉(zhuǎn)?;钚员容^低,通過轉(zhuǎn)基因手段,提高其在細胞內(nèi)的表達可提高其轉(zhuǎn)?;芰M而提高PHA的合成能力[22]。

      3-羥基丁酸與 3-羥基戊酸共聚物 P(3HB-co-3HV)在海洋作業(yè)環(huán)境和生物醫(yī)藥方面具有廣泛用途,通常情況下可由微生物在含有葡萄糖和丙酸混合碳源條件下合成[23]。圖 6路線 D為蘇氨酸合成P(3HB-co-3HV) 的途徑。首先由蘇氨酸脫氨酶催化(IlvA)蘇氨酸生成2-酮丁酸,隨后由丙酮酸脫氫酶還原 2-酮丁酸生成丙酰輔酶 A,接著酮硫酯酶(BktB)催化生成R-3羥基戊酰輔酶A,PHA合成酶催化R-3羥基戊酸整合到P(3HB-co-3HV)聚合物中。該途徑已證實存在于植物細胞中,但是否存在于細菌中還未證實。

      圖6路線E為從三羧酸循環(huán)合成3-羥基戊酸酯的途徑。由甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶催化琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)镽-2-甲基丙二酰輔酶A,再由甲基丙二酰輔酶A脫羧酶(YgfgG)催化成丙酰輔酶A,酮硫解酶把丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-酮戊酰輔酶A,酮還原酶PhaB催化3-酮戊酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)镽-3-羥基戊酰輔酶A。最后,PHA合成酶(PhaC)以R-3-羥基戊酰輔酶 A為底物合成 3-羥基戊酸聚酯 P(3HV)。

      圖6路線F為4-羥基丁酸聚酯P(4HB)的合成途徑。琥珀酸脫氫酶(SucD)催化琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁岚肴儆?-羥基丁酸脫氫酶(4HbD)催化琥珀酸半醛轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基丁酸(4HB),接著由4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Cat1或者Cat2)把4-羥基丁酸生成4-羥基丁酰輔酶A,最后由PhaC合成4-羥基丁酸聚酯。

      2.2 從非相關碳源合成中長鏈PHAMCL途徑

      圖7為從非相關碳源合成中長鏈單體的4種途徑,這些途徑都來源于脂肪酸的生物合成途徑。脂肪酸合成途徑廣泛存在于各類微生物細胞中,為降低 PHA的生產(chǎn)成本,可通過基因重組技術把下述PHA合成系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到光合微生物細胞內(nèi),因光合微生物可以利用二氧化碳替代傳統(tǒng)的糖或者脂肪酸作為碳源來合成 PHA,這樣將有效降低 PHA的生產(chǎn)成本。

      圖7路線A為乙酰輔酶A合成聚3-羥基烷酸酯P(3HA) 途徑[24]。乙酰輔酶A經(jīng)由乙酰輔酶A脫羧酶(AccA)催化生成丙二酰輔酶A,丙二酰輔酶A:ACP?;D(zhuǎn)移酶(FabD)催化丙二酰輔酶A生成丙二酰-ACP,再由 3-羥基乙酰-ACP硫酯酶(FabG)合成3-羥基乙酰ACP,3-羥基乙酰ACP經(jīng)過β氧化途徑和PHA合成酶(PhaC)的作用下合成聚3-羥基烷酸酯P(3HA)。Klinke等[25]研究表明,該途徑需要去除宿主菌株內(nèi)β氧化途徑中的相關酶的基因才可達到更好的合成效果。

      圖6 短鏈PHA的合成途徑

      圖 7路線 B為通過3-羥基乙酰-ACP硫酯酶(FabG)合成 PHA途徑。3-羥基乙酰-ACP經(jīng)由FabG合成3-羥基烷酸,乙酰輔酶A合成酶(AlkK)催化3-羥基烷酸合成3-羥基乙酰輔酶A,再由PHA合成酶催化合成PHA[26-27]。圖7路線C、D為重組大腸桿菌在過量葡萄糖的存在下合成PHA的途徑。重組菌株帶有特異位點的3-酮酰乙酰載體蛋白合成酶Ⅲ的基因的表達,可改變 PHA合成酶對其底物的特異性基因從而可使中長鏈 PHA共聚物在細胞內(nèi)得以合成[28-29]。

      3 近年來PHA的生物合成

      3.1 新發(fā)現(xiàn)的合成PHA菌種

      到目前為止,發(fā)現(xiàn)有過300多種菌種能夠合成PHA。盡管如此,人們?nèi)匀辉趯ふ依硐氲暮铣蒔HA的菌種。表2為近年來篩選或基因重組得到的具有合成 PHA能力的菌種。從表中可以看出,大部分菌種合成 PHA的能力并不是很高,最高也只能合成占細胞干重的87%。有研究表明,藻類細菌也可以用來合成PHA[37],但是和那些異養(yǎng)細菌相比較,PHA在細胞中的合成量非常低。從表2可以看出,Spirulina subsalsa只能合成占細胞干重的7.45%。雖然藻類細菌合成 PHA的能力非常有限,但是利用該類菌種來合成 PHA同樣具有優(yōu)勢。該類微生物能在含有極少營養(yǎng)的條件下生長,可利用太陽能進行光合作用和二氧化碳作為碳源合成PHA,可大大減少PHA的生產(chǎn)成本。

      通過基因重組能快速提高微生物合成 PHA能力且可改變微生物胞內(nèi)合成的 PHA單體組分。近年來,越來越多的基因工程菌被構(gòu)建用來合成PHA,表3為合成PHA的重組大腸桿菌。Ma等[43]對Pseudomonas putidakt2442進行基因重組,敲除了編碼3-羥酰-輔酶A脫氫酶的基因,得到的突變菌株能合成只具有兩種單體的中長鏈PHA。通過敲除該菌株的β-氧化途徑的基因fadBA時,以葡萄糖或其它奇數(shù)碳原子脂肪酸為碳源,重組菌只合成具有一種單體組分的 PHA,即 3-羥基庚酸酯的均聚物。Jun等[44]通過重新構(gòu)建重組菌Cupriavidus necatorH16CAc,使得該突變菌合成的中長鏈PHA中3-羥基戊酸單體組分含量提高。

      圖7 中長鏈PHA合成途徑

      3.2 利用廉價碳源合成PHA

      雖然 PHA聚合物具有在自然條件下能被完全降解的優(yōu)點,可作為傳統(tǒng)塑料的替代物。但時至今日,PHA并沒有得到大規(guī)模的應用。其中最主要的原因是生產(chǎn) PHA的成本太高,由細菌發(fā)酵生產(chǎn)的PHA的成本為傳統(tǒng)塑料的5~10倍。所以,只有降低PHA的生產(chǎn)成本,才能使得PHA得到廣泛的應用。

      表2 近年來發(fā)現(xiàn)的合成PHA菌株

      表3合成PHA的重組大腸桿菌

      在 PHA發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基碳源占據(jù)生產(chǎn)成本的比重很大,有時可達生產(chǎn)成本的50%[50]。為降低成本,可利用相對較廉價的碳源來發(fā)酵合成PHA。有學者利用植物油、糖漿、乳清等廉價碳源來合成生產(chǎn) PHA[51-53]。Haas等[54]利用土豆淀粉作為碳源,用R.eutrophaNCIMB 11559合成PHB,得到了179 g/L的細胞濃度,其中PHA占細胞干重的55%。Sheu等[55]研究了用淀粉和戊酸為混合碳源,Caldimonas taiwanensis在氮限制的條件下(C/N比為30)來合成雜聚物P(3HB-co-3HV)。在50 ℃、32 h的培養(yǎng)條件下,該菌種利用戊酸作為3-羥基戊酸的前體,通過控制戊酸的濃度,可以控制PHA中的3-羥基戊酸(3HV)組分的摩爾分數(shù)從10%到95%。

      利用工業(yè)廢棄物作為廉價碳源來合成生產(chǎn)PHA不僅能降低其生產(chǎn)成本,更具有環(huán)保意義。Mohd等[30]利用棕油廠排出物作為Comamonassp. EB172的碳源來合成P(HB-co-HV)雜聚物,通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基起始pH值可以控制雜聚物中的3-羥基戊酸成分為45%~86%(摩爾分數(shù)),得到的雜聚物數(shù)均分子量為153~412 kD。Bengtsson等[56]用活性污泥處理造紙廠廢水可得到聚羥基丁酸戊酸酯(PHBV),通過 3個階段的處理過程,其 PHBV雜聚物含量占污泥干重的48.2%。 Herrema等[57]發(fā)明一種方法:利用揮發(fā)性有機化合物(VOC)作為廉價碳源來合成PHA,VOC先經(jīng)過甲烷-氧化微生物處理,該類微生物中含有一種為甲烷單氧酶(MMO)的催化劑,該催化劑能把VOC氧化成具有PHA合成能力的微生物可利用的碳源。利用此方法,細胞中合成的 PHA含量最高可達細胞干重的75%,1 kg的VOC可合成得到0.25 kg的PHA。

      最近,有人研究利用食品加工廢棄物作為生物質(zhì)精煉的原料來生產(chǎn)更具有附加的值產(chǎn)品[58]。乳清是常見的食品工業(yè)廢棄物,是奶酪生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)品。因乳清廢水具有很高的需氧量,直接排放容易引起周圍環(huán)境水體惡化。Koller等[53]發(fā)現(xiàn)水解后的乳清可被Pseudomonas hydrogenovora利用來合成PHB,最終可得到5 g/L的生物量,其中PHB占細胞干重的12%。在以脫蛋白乳清和乳酸為混合碳源時,具有Azotobactersp.FA8 PHA合成酶的重組大腸桿菌E. coliK24K最終的生物量可達 58.2 g/L,合成的 PHB的占細胞干重的46.9%。

      4 展 望

      目前雖然發(fā)現(xiàn)了很多種由不同單體組成的PHA,但商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的只有PHB和P(3HB-3HV)兩種聚合物。原因之一是和已有的石化塑料相比,PHA的熱機械性質(zhì)和加工特性相對較差,應用范圍比較窄,只能作為一般的食品包裝塑料等較低級的功能來使用;另一個重要的原因就是生產(chǎn) PHA的成本太高(4~6 USD/kg),遠遠高于傳統(tǒng)的石化塑料的價格。

      隨著對 PHA生物合成途徑的深入理解和對合成過程中的相關酶進行操縱,輔以基因重組技術可篩選高產(chǎn)量PHA的細菌,將顯著地降低PHA的生產(chǎn)成本。一方面,篩選能利用廉價碳源來合成PHA的菌種可進一步降低 PHA的成本,如上所述的Spirulina subsalsa,雖然其細胞內(nèi)的PHB的含量比較低,但該菌種能利用光合作用以CO2為碳源,在開放的環(huán)境中培養(yǎng)合成PHB,不需要滅菌的相關操作,因而可大幅度地降低PHA的生產(chǎn)成本;另一方面,通過對細菌合成PHA過程中的相關酶基因進行修飾,結(jié)合不同的發(fā)酵策略可以改變PHA中的單體組成,使得PHA具有不同的力學和加工性能,拓寬PHA的應用范圍。隨著PHA的生產(chǎn)成本降低和加工性能的改善,PHA必將得到廣泛的應用。

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      Advance in biosynthesis of polyhydroxyalkanoate

      HUANG Jinbiao1,SHANG Long’an2
      (1Department of Chemical and Biochemical Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310027,Zhejiang,China;2Ningbo Institute of Technology,Zhejiang University,Ningbo 315100,Zhejiang,China)

      Polyhydroxyalkanoate(PHA)is a type of polymer which can be synthesized by a variety of microbes. This new kind of material can be used as a substitute for the traditional petrochemical plastics because of its complete bio-degradability. PHA biosynthesis paths in different microbes have been studied w idely and extensively to these days. In order to reduce PHA price and realize industrialisation,many researches have been focused on screening high-productivity strain and using cheap carbon source to synthesis PHA. This review introduces the PHA biosynthesis pathways and advance in biosynthesis of PHA.

      polyhydroxyalkanoates;biosynthesis;bio-degradable plastics;cheap carbon resource

      TQ 321

      A

      1000–6613(2011)09–2041–08

      2011-03-24;修改稿日期:2011-04-11。

      黃錦標(1982—),碩士。聯(lián)系人:尚龍安,教授。E-mail lashang@nit.net.cn。

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