許 華， 張 潔， 喻 靜

(1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2太原市婦幼保健院藥劑科，山西 太原 030012；3廣州市質量監(jiān)督檢測研究院，廣東 廣州 510110)

·實驗技術·

合成紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇作用的研究

許 華1△， 張 潔2， 喻 靜3

(1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2太原市婦幼保健院藥劑科，山西 太原 030012；3廣州市質量監(jiān)督檢測研究院，廣東 廣州 510110)

目的觀察合成紅藻氨酸(SKA) 誘發(fā)大鼠癲癇的作用及其作用特點。方法Wistar大鼠40只，隨機分為正常對照組、SKA 12 mg/kg、SKA 10 mg/kg 和 SKA 5 mg/kg 劑量組及紅藻氨酸 (KA)10 mg/kg陽性對照組。腹腔注射給藥，連續(xù)8 h觀察大鼠癲癇發(fā)作的行為學變化及連續(xù)3.5 h記錄其腦電圖變化。結果合成紅藻氨酸5、10、12 mg/kg 腹腔注射，可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，其行為學及腦電改變與KA對照組無明顯差異。但合成紅藻氨酸誘發(fā)動物癲癇呈現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定及階段性明顯的特征，且大鼠的死亡率較天然紅藻氨酸低。結論合成紅藻氨酸腹腔注射可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，以10 mg/kg為較合適劑量。

合成紅藻氨酸； 模型，癲癇

紅藻氨酸(kainic acid， KA)是紅海藻海人草(Digeneasimplex)提取物，化學名為2-羧基-3羧甲基-4異丙烯基吡咯烷，與谷氨酸(glutamic acid,Glu)結構相似，可作用于脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Glu受體，既可直接興奮神經(jīng)元，又可增強鈉離子的通透性而使神經(jīng)細胞去極化，誘發(fā)癲癇的發(fā)生[1]。目前KA已作為癲癇急、慢性造模劑，廣泛應用于癲癇的病理生理學研究及抗癲癇藥物篩選等研究中[2-5]。本文觀察了KA的人工合成品，即合成紅藻氨酸(synthetical kainic acid，SKA)是否具有誘發(fā)大鼠癲癇的作用，并觀察了其誘發(fā)癲癇的作用特點。

材 料 和 方 法

1藥品

SKA由廣州諾東生物科技有限公司提供，白色針狀晶體，分子式：C10H15NO4·H2O。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測結果顯示，其分子量為231.2，純度大于99%，批號為nd000700312。臨用時用生理鹽水配制成所需濃度，按5 mL/kg BW腹腔注射給藥。對照品KA購自Sigma，批號為086K1524，配制方法同SKA。

2動物

SPF級Wistar成年健康大鼠，雌雄各半，體重(192±22)g，購于第一軍醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號為0027687。大鼠自由飲食飲水，實驗前在室溫(24±2)℃實驗室適應性飼養(yǎng)1周。

3分組及劑量設計

已有大量用天然提取物紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇的研究報道，其對大鼠腹腔注射常用劑量為10 mg/kg[6-8]。本試驗設計SKA 12 mg/kg、10 mg/kg和5 mg/kg 3個劑量組進行實驗，同時設立KA(10 mg/kg)陽性對照組和正常(生理鹽水)對照組。

4方法

4.1行為學觀察 大鼠40只，隨機分為5個組，每組8只，分別為正常對照組、SKA組高、中、低劑量組(分別為12 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg)和KA陽性對照組(劑量10 mg/kg)。均于上午9時左右腹腔注射給藥。用藥后觀察不同組別大鼠8 h內癲癇發(fā)作情況如潛伏期、發(fā)作級別、發(fā)作持續(xù)時間、發(fā)作次數(shù)等行為學變化。行為學表現(xiàn)分級參照文獻標準[9]：Ⅰ級：凝視等；Ⅱ級：I級+節(jié)律性點頭；Ⅲ級：II級+雙側前肢陣攣；Ⅳ級：III級+后肢站立；Ⅴ級：IV級+摔倒/四肢抽搐，并計數(shù)24 h內各組動物的死亡數(shù)。

4.2腦電圖觀察 另設24只大鼠，分為3組，即正常對照組、SKA 10 mg/kg組和KA 10 mg/kg組。乙醚麻醉大鼠，使其俯臥位固定于腦立體定位儀上，待其清醒約10 min后進行腦電監(jiān)測。應用BL-420腦電監(jiān)測系統(tǒng)對大鼠進行腦電波記錄。采用頭皮電極，在大鼠雙側顳部頭皮處各插入1根針電極，參考電極插入鼻尖部，組成2個導聯(lián)：(1) T1：左顳葉-參考電極；(2) T2：右顳葉-參考電極[10]。準備工作完畢后，先觀察5-10 min，待大鼠適應腦立體定位儀并波形穩(wěn)定后開始給藥并計時，連續(xù)3.5 h監(jiān)測腦電變化及相應行為改變。

5統(tǒng)計學處理

結 果

1SKA引起的大鼠癲癇樣發(fā)作行為學變化

腹腔注射10 mg/kg SKA后約5 min，大鼠出現(xiàn)凝視行為(Ⅰ級)，繼之分別在約23 min、97 min、140 min和129 min動物順序出現(xiàn)Ⅱ-Ⅴ級癲癇發(fā)作。約43 min后出現(xiàn)“濕狗樣” 抖身(WDS)。每次發(fā)作時間為2-10 s，發(fā)作間期動物呈呆滯不動或燥動不安。反復發(fā)作3-4 h后動物癥狀開始減輕，7-8 h 發(fā)作基本停止，此后動物呈衰竭狀態(tài)而呆滯不動；14 h后基本恢復正常。其它劑量組動物行為學改變詳見表1-5。SKA(10 mg/kg)組死亡率為0，而同劑量KA組為37%。

表1SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同級別的動物數(shù)

GroupThegradesofepilepticseizure(n)ⅠⅡⅢⅣⅤNormalcontrol00000SKA(12mg/kg)8/88/88/88/88/8SKA(10mg/kg)8/88/88/84/81/8SKA(5mg/kg)5/55/55/50/50/5KA(10mg/kg)8/88/85/85/82/8

表2 SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同級別潛伏期

*P<0.05vsKA (10 mg/kg) group;nsee table 1.

表3 SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同階段的持續(xù)時間

The persistence time means the longest time at different grades.*P<0.05,**P<0.01vsKA (10 mg/kg) group;nsee table 1.

表4 SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同級別特征性動作的次數(shù)

The frequency of Ⅰ, Ⅱand Ⅲ grades means the total numbers which were recorded before the characteristic behaviors of next grade appeared. The frequency of Ⅳ or Ⅴ grade indicates the total number of the characteristic behaviors in Ⅰto Ⅴ grade.△P>0.05vsKA (10 mg/kg) group.nsee table 1.

表5各組大鼠濕狗樣抖動(wet-dogshake)表現(xiàn)

GroupLatency(min)Persistencetime(min)TotalnumberMaximumnumberin1minNormalcontrol0000SKA(12mg/kg)43.38±8.4746.25±12.1722.13±7.383.50±1.41SKA(10mg/kg)44.75±11.83△58.14±27.20△23.88±12.86△5.00±2.98△SKA(5mg/kg)18.67±7.57136.67±90.7326.33±14.054.33±2.08KA(10mg/kg)42.40±2.3048.57±28.8024.00±8.944.60±0.89

△P>0.05vsKA (10 mg/kg) group.nsee table 1.

2SKA用藥后大鼠腦電的變化

正常大鼠腦電圖波幅低，大概在10 μV左右波動，節(jié)律平穩(wěn)，頻率約110 Hz左右，見圖1。注藥后至癲癇發(fā)作時間段內，腦電波形無明顯改變。當大鼠出現(xiàn)抽搐等癲癇行為時，可見典型的高幅棘波(圖2)，但頻率改變不明顯。繼之出現(xiàn)尖波和尖慢疊加波，并可觀察到大鼠一些相伴行的行為表現(xiàn)，如豎尾(圖3)、劇烈甩尾(圖4)等。

討 論

KA由Murakami等于1953年從紅海藻中提取，最初主要用途為驅蟲劑，后用于模擬腦退變的研究。但其價格可高達每10 mg 約200余美元，使得不少研究者不得已采用一些模擬腦退變效果并不顯著、但可以減少其研究費用的其它造模劑。近年來一些藥學家開始致力于紅藻氨酸的研制，如在具備海水的暖房內種植海藻然后生產(chǎn)紅藻氨酸，或仍以傳統(tǒng)的海人草作原料提取紅藻氨酸。本文研究了一種完全合成的紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的作用。

1合成紅藻氨酸(SKA)所致大鼠癲癇急性發(fā)作特點

1.1癲癇階段性發(fā)作特征[11,12]I級發(fā)作：大鼠注射SKA后，均迅速出現(xiàn)呼吸急促、弓背、豎毛等狀態(tài)，約4 min大多動物進入抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為靜伏少動、眼神呆滯，此期內可出現(xiàn)凝視(Ⅰ級特征)、眼裂變大、雙眼球突出及顏面肌輕微抽搐。II級發(fā)作：注射SKA后約23 min，在Ⅰ級基礎上出現(xiàn)節(jié)律性的點頭(Ⅱ級特征)，平均1.5次/秒；此期可見大鼠尾硬，甚或垂直豎起，發(fā)作完畢緩解變軟。Ⅲ級發(fā)作：注射SKA后約98 min，在Ⅱ級發(fā)作的基礎上，動物出現(xiàn)雙側前肢陣攣(Ⅲ級特征)，完畢后動物可正?；顒右欢螘r間后，再次發(fā)生陣攣，2-3次之后出現(xiàn)雙側前肢陣攣伴后肢站立(IV級)狀態(tài)。IV級發(fā)作：注藥后1-3.5 h，動物出現(xiàn)雙側前肢陣攣伴后肢站立(IV級特征)，可在較短時間內連續(xù)出現(xiàn)；有時觀察不到單獨的III級，有時IV級在III級之前，III級IV級經(jīng)常交替出現(xiàn)，界限模糊。Ⅴ級發(fā)作：Ⅴ級是在Ⅳ級基礎上的大發(fā)作，可見大鼠后肢豎直立起，向一側或向后翻倒，或摔倒后快速爬起，有些則是摔倒后保持側臥并四肢抽搐，連續(xù)抽或僅抽動1次。在Ⅳ級-Ⅴ級之前均伴有明顯的咀嚼和眨眼，甚至可聽到牙齒碰擊的聲音，并大量流涎，或口吐白沫；眨眼狀態(tài)頻度甚快，甚至呈現(xiàn)似閉眼或半閉眼狀態(tài)，多為單只眼表現(xiàn)。閉眼與咀嚼同時進行，是動物進入IV-V級的先兆。

Figure 1. Normal electroencephalogram in rats showed that the wave amplitude fluctuated at 10 μV and the frequency was 110 to 120 Hz.

圖1大鼠正常腦電圖

Figure 2. The rat’s electroencephalogram recorded at 96 min after SKA (10mg/kg) injection showed that the amplitude evidently increased. Meanwhile the rat had convulsion, corresponding to Ⅲ grade epileptic seizure.

圖2SKA10mg/kg注藥后96min腦電圖

Figure 3. The rat’s electroencephalogram recorded at 132 min after SKA (10mg/kg) injection showed that the fused-wave appeared. Meanwhile the rat’s tail reared, corresponding to IV grade epileptic seizure.

圖3SKA10mg/kg注藥后132min腦電圖

Figure 4. The rat’s electroencephalogram recorded at 137 min after SKA (10mg/kg) injection showed that many independent waves were confluent. Meanwhile the rat was gravis tail-flicked,corresponding to V grade epileptic seizure.

圖4SKA10mg/kg注藥后137min大鼠腦電圖

1.2癲癇發(fā)作的某些特殊行為 (1)轉圈行為和扭身動作：大鼠在近Ⅲ級發(fā)作之前，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級發(fā)作間期和V級發(fā)作之后的緩解期，會出現(xiàn)以尾部為中心或以一定半徑朝同一方向進行的轉圈行為，時快時慢，多持續(xù)較長時間。另外，尚可見動物出現(xiàn)扭身動作-大鼠保持臀部坐立姿勢，頭向后下扭向尾根，甚或吸咬尾根，有時身體扭曲過度進而摔倒。(2)拍擊地面、身體挪移或弓背倒退行走：除經(jīng)典的Ⅳ級、Ⅴ級癥狀外，在Ⅲ級發(fā)作之后動物還會出現(xiàn)如下幾種狀態(tài)：a、雙前肢或四肢同時拍擊地面。如是四肢同時拍擊，動物趴位并弓背，似輕微蹦起。b、大鼠坐位，雙前肢向前推地身體向后頓挫性挪移。c、動物弓背低頭倒退行走。(3)其它癥狀：有些動物雖沒有出現(xiàn)典型的Ⅳ、Ⅴ級癥狀，但出現(xiàn)身體豎立、向上劇烈竄跳，跳起時左右亂撞，力度大、發(fā)作猛，跳躍完畢后大鼠摔落癱軟在地，這也是大發(fā)作的一種表現(xiàn)，可歸為大發(fā)作。值得注意的是本實驗中“濕狗樣”抖動(WDS)這一癲癇經(jīng)典動作是在看到明顯的節(jié)律性點頭(Ⅱ級)之后才出現(xiàn)的，緊接著才是Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級的連續(xù)發(fā)作，并且WDS動作持續(xù)時間較長，發(fā)作頻繁，并非像使用天然提取KA造模的大量文獻所述，即WDS是癲癇發(fā)作的前驅動作，甚至有些分級標準將其歸入Ⅰ級，與本次實驗結果不相符。

大發(fā)作完畢后，大鼠癱軟在地，時間長短不一，少數(shù)動物在8 h內可恢復正常，大部分則不能，個別動物一直處于轉圈狀態(tài)。只能誘發(fā)到Ⅲ級發(fā)作的大鼠在Ⅲ級發(fā)作后表現(xiàn)為頻繁的搓臉洗澡動作，或采用直立坐姿，頭部低垂，雙前肢有節(jié)律的揉搓下腹部。8 h內死亡的大鼠，在死亡之前都會出現(xiàn)1次大發(fā)作，以身體縱軸為軸線，從地面旋轉著向空中上升，大約離地1-3 cm高度短暫停留空中，旋轉1或者2圈后落下，此時動物已近死亡狀態(tài)。檢查死亡大鼠，有些可見口鼻部有血沫，或前后肢指趾有血跡或出現(xiàn)血淚癥。

2SKA所致大鼠癲癇腦電圖及其特點

發(fā)生特征性癲癇行為同時的腦電圖均可見若干個獨立波形合并，有些甚至偏離基線，波形極不規(guī)則。待癲癇緩解時，此特殊波形消失，并迅速恢復正常波形。SKA與KA相應時間段腦電波形相似。由于大鼠固定于腦立體定位儀上，判斷其是否進入典型癲癇狀態(tài)最可靠易行的方法是觀察大鼠的尾部變化。發(fā)作初期，大鼠尾僵硬，似棍狀，隨后垂直豎起，以尾根部為圓心垂直于身體做圓周動作，即“甩尾”，幾乎出現(xiàn)在整個發(fā)作期，僅速度和尾硬程度不同。在發(fā)作前或發(fā)作過后緩解期，幾分鐘到十幾分鐘不等發(fā)生1次甩尾動作，緩慢旋轉。偶見抽搐，但并未觀察到單獨的肢體陣攣。在整個發(fā)作期可見大鼠背毛豎起。在出現(xiàn)上述行為表現(xiàn)時，大鼠腦電波形并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性變化，其頻率和正常狀態(tài)無明顯差異，但波幅大多明顯增高。

總之，合成紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇作用的結果顯示，SKA 5-12 mg/kg腹腔注射可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，以10 mg/kg劑量為佳。其誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的行為學特征及腦電改變與天然紅藻氨酸對照組無明顯差異，但合成紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的階段性明顯、行為學表現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定，死亡率亦較低，原因可能與其純度較高有關。

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Synthetickainateacidinducesseizuresinrats

XU Hua1, ZHANG Jie2, YU Jing3

(1PharmacyCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2MaternalandChildHealthHospitalofTaiyuan,Taiyuan030012,China;3GuangzhouQualitySupervisionandTestingInstitute,Guangzhou510110,China.E-mail:huax-mail@163.com)

AIM: To observe the effect of synthetical kainic acid (SKA) on inducing epileptic seizure in rats.METHODSForty Wistar rats were divided into normal control group, 5 mg/kg, 10 mg/kg and 12 mg/kg SKA-treated groups and kainic acid (KA) positive control group. The SKA was injected intraperitoneally. The changes of the epileptic behaviors were observed for 8 h successively and the electroencephalography was recorded for 3.5 h.RESULTSSKA induced epileptic seizures at the dose of 5-12 mg/kg by intraperitoneal injection. No apparently difference between SKA and KA on the changes of epileptic behaviors or electroencephalography was observed. However, the epileptic seizure induced by SKA showed obvious stages, regular pattern and action steady. In addition, SKA caused lower fatality than KA did.CONCLUSIONSKA induces epileptic seizure in rats and the dose of 10 mg/kg by intraperitoneal injection is the optimal.

Synthetic kainate acid; Models,epilepsy

R742.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.041

1000-4718(2011)01-0204-05

2010-07-28

2010-10-19

△通訊作者 Tel: 020-85224766; E-mail:huax-mail@163.com