蘆筍多糖提取純化工藝及其體外抗氧化研究

李 姣，王 珂，王瑞坡，趙 頔，瞿偉菁*

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062)

蘆筍多糖提取純化工藝及其體外抗氧化研究

李 姣，王 珂，王瑞坡，趙 頔，瞿偉菁*

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062)

目的：探討蘆筍多糖的提取純化方法及其體外抗氧化活性。方法：采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計，考察提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)等因素對蘆筍粗多糖浸提效果的影響。進(jìn)一步以酶法除蛋白純化粗多糖，探索3種蛋白酶作用的最佳工藝條件及其除蛋白效果，用硫酸-苯酚法和DNS法定量分析粗多糖；并研究蘆筍多糖對自由基的清除作用以及對紅細(xì)胞溶血、肝線粒體腫大的抑制作用。結(jié)果：在提取溫度100℃、提取時間3h、料液比1:20(g/mL)，提取1次條件下，蘆筍粗多糖的得率最高，為(8.50±1.07)%，經(jīng)堿性蛋白酶純化后，純度可達(dá)(52.40±0.47)%。蘆筍多糖在體外體系中可顯著清除DPPH自由基、·OH、O2－·，并具有抑制紅細(xì)胞溶血，抑制肝線粒體腫大的作用。結(jié)論：蘆筍多糖具有較好的抗氧化活性。

蘆筍多糖；提取；純化；抗氧化

蘆筍(Asparagus officinalis Linn.)為百合科天門冬屬植物，學(xué)名石刁柏，又名蘆荀、龍須菜等。蘆筍含有游離氨基酸、維生素、微量元素等多種營養(yǎng)成分，以及皂苷、多糖、黃酮等藥用成分[1]。藥理學(xué)研究表明蘆筍提取物對高脂血癥[2]、糖尿病[3]、癌癥[4]等有一定療效，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。多糖是蘆筍的重要活性成分，因其毒性小，具有廣譜免疫促進(jìn)等作用，引起了人們極大的關(guān)注。目前，以新鮮蘆筍可食部分為原料的蘆筍多糖的研究主要集中在提取工藝[5]、增強(qiáng)免疫力[2]、抗衰老[6]、抗腫瘤[7]活性等方面。有關(guān)蘆筍老莖的活性物質(zhì)多糖的提取及抗氧化作用的研究未見報道。在蘆筍食品生產(chǎn)過程中約有40%的老莖被廢棄[8]，不僅浪費(fèi)資源，而且有礙環(huán)境友好型產(chǎn)業(yè)建設(shè)。本實(shí)驗(yàn)以綠蘆筍采收后的廢棄老莖為原料，對蘆筍多糖(polysaccharides from residue of asparagus，PRA)提取的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行探索，采用蛋白酶法除蛋白[9]，并比較木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶對粗多糖的純化效果。超氧陰離子自由基、羥自由基是生物體中主要的活性氧自由基，由它們所引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，是人類疾病發(fā)生和衰老的重要原因[10]，而紅細(xì)胞在腫瘤免疫中具有識別、黏附、殺傷抗原等作用。有報道表明蘆筍多糖可提高荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能[11]，鑒于此本實(shí)驗(yàn)以體外抗氧化系統(tǒng)測定蘆筍老莖多糖對自由基的清除率以及對紅細(xì)胞氧化溶血、線粒體腫脹的抑制作用，比較不同質(zhì)量濃度PRA的抗氧化活性，以期為PRA資源的深度利用、延長PRA資源加工的產(chǎn)業(yè)鏈提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蘆筍老莖 上海合興蔬菜公司；SD(Sprague-Dawley)大鼠(滬動合證字152號) 上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司；濃硫酸、5%苯酚、HCl、Tris-HCl緩沖液(pH8.2)、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrayl，DPPH)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、木瓜蛋白酶(papain)、中性蛋白酶(neutral protease)、堿性蛋白酶(alkali protease)均為國產(chǎn)市售。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722光柵分光光度計 上海市第三分析儀器廠；高速臺式離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；梅特勒-托利多B-L系列電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Bio-tek exl 800酶聯(lián)免疫測定儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆筍預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取一定量干燥的蘆筍老莖粉末，置于圓底燒瓶中，用10倍體積70%的乙醇回流2次，每次3h。棄去溶劑，殘?jiān)L(fēng)干備用。

1.3.2 蘆筍多糖最佳浸提條件的確立

綜合考慮溫度、時間、料液比、提取次數(shù)等因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計，將預(yù)處理的蘆筍按設(shè)計方案在熱水浴中回流浸提，抽濾，收集濾液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加入乙醇，使乙醇最終體積達(dá)到80%以上，靜置過夜。將所得沉淀物在4000r/min條件離心15min，得到蘆筍粗多糖(PRA)。

1.3.3 酶法除蛋白

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PRA溶液，設(shè)計木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶作用最佳條件的正交試驗(yàn)。按試驗(yàn)得到的酶最適溫度、作用時間、酶質(zhì)量濃度等對PRA進(jìn)行酶解。95%乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過夜。在4000r/min條件離心15min去上清液，沉淀冷凍干燥，比較3種酶純化后的多糖純度。

1.3.4 多糖含量的測定

用硫酸-苯酚法測定粗多糖中總糖的含量，DNS法測定還原糖的含量。

多糖質(zhì)量=提取物中總糖質(zhì)量－提取物中還原糖質(zhì)量

1.3.4.1 硫酸苯酚法測總糖

精密量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 0.2mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，蒸餾水補(bǔ)足至1.0mL。加入5%的苯酚溶液1mL，加入5mL濃硫酸。放置10min后沸水浴加熱20min。室溫條件下于波長490nm處測定吸光度[12]。根據(jù)所測量吸光度得到線性回歸方程y=3.7116x＋0.0046(R2=0.9981)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計算出多糖水解液中總糖含量。

1.3.4.2 DNS法測還原糖

精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL 1.0mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水補(bǔ)足至0.5mL。加入DNS液1mL[13]，沸水浴加熱2min顯色。加入4.5mL蒸餾水，在波長540nm處比色?？捎嬎愠龆嗵撬庖褐羞€原糖含量。

1.4 蘆筍多糖體外抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH自由基體系

配置質(zhì)量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、10、16mg/mL的PRA溶液。在1.9mL 0.065mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液[14]中加入0.1mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。反應(yīng)30min，于波長517nm處測定吸光度Ai。以相應(yīng)溶劑代替樣品作為空白對照，吸光度為Amax。

1.4.2 超氧陰離子自由基體系

按1.4.1節(jié)方法配置PRA溶液。采用鄰苯三酚自氧化法獲得O2·[15]。取4.5mL 0.05mol/L Tris-HCl緩沖液，加入1mL樣品溶液和0.4mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液，25℃反應(yīng)5min后加入1mL 8mmol/L HCl溶液終止反應(yīng)，在波長299nm處測定樣品溶液的吸光度Ai，空白組以相應(yīng)溶劑代替樣品溶液，吸光度為A0。

1.4.3 對羥自由基(·OH)的清除作用

參照Fenton反應(yīng)方法[16]建立羥自由基產(chǎn)生體系模型。在試管中依次加入6mmol/L FeSO4溶液2mL，多糖溶液(按1.4.1節(jié)方法配置)2mL 6mmol/L H2O2溶液2mL，靜置10min。再加入6mmol/L水楊酸溶液2mL，靜置30min后于波長510nm處測吸光度A0，用蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度Ax。

1.4.4 對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的影響

SD大鼠取血，4℃、3000r/min離心10min，生理鹽水洗滌3次，配成0.5%紅細(xì)胞懸液[17]。將紅細(xì)胞懸液0.5mL與0.1mL不同質(zhì)量濃度(0.5、1、2、5、10mg/mL)的多糖溶液混合。37℃溫育10min后加入100mmol/L H2O2溶液0.1mL，繼續(xù)溫浴1h，稀釋4倍體積后3000r/min離心10min，取上清液在波長415nm處測吸光度，以生理鹽水為空白，以對照組為100%溶血，計算添加多糖溶液后的溶血度。

1.4.5 對大鼠肝線粒體腫脹度的影響

取新鮮SD大鼠肝組織，按1:9的比例加入預(yù)冷PBS，冰浴勻漿，在4℃、1000r/min條件下離心15min，收集上清液。以10000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，收集沉淀，用PBS將沉淀制成懸液?？捡R斯亮藍(lán)法測定該懸液中的蛋白含量，調(diào)整懸浮液蛋白量至0.5mg/mL，4℃保存?zhèn)溆肹18-19]。

取3.0mL懸浮液，加入0.4mL不同質(zhì)量濃度(0.5、1、2、5、10mg/mL)多糖溶液，用0.4mL 0.5mmol/L FeSO4及0.4mL 0.5mmol/L VC激發(fā)線粒體膨脹，37℃溫浴，測定0min和60min時懸浮液的吸光度A0、At，計算線粒體的腫脹度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“x±s”表示，用SPSS軟件進(jìn)行一維方差分析(One-Way ANOVA)，組間進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍多糖提取工藝優(yōu)化的正交分析

由表1可得，提取溫度100℃，提取時間3h，料液比1:20，浸提1次得到的粗多糖得率最高為(8.50±1.07)%。由極差分析可知，影響粗多糖提取率的各因素影響力大小依次為提取溫度＞提取時間＞料液比＞提取次數(shù)。浸提的時間延長，次數(shù)較多時，提取液中的總糖含量上升；但同時，還原糖含量亦大幅上升，對提高多糖提取率的效果不明顯。因此，考慮到節(jié)約成本，將蘆筍多糖水提工藝條件確定為提取溫度100℃、提取時間3h、料液比1:20(g/mL)，提取1次。

表1 蘆筍多糖水提工藝正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 1 Scheme and experimental results of orthogonal array design for optimizing extraction process for polysaccharides from green asparagus

2.2 蘆筍多糖除蛋白正交分析

表2 蛋白酶純化多糖的正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of orthogonal array designfor optimizing deproteinization process for crude green asparagus polysaccharides

由表2可知，酶處理的各因素影響力大小依次是提取溫度＞提取時間＞酶質(zhì)量濃度。木瓜蛋白酶處理的最佳條件為60℃、1.5h，酶質(zhì)量濃度0.1mg/mL；中性蛋白酶處理的最佳條件為50℃、1.5h，酶質(zhì)量濃度0.5mg/mL；堿性蛋白酶處理的最佳條件為50℃、1.5h，酶質(zhì)量濃度0.5mg/mL。在最適條件下，3種酶純化后的多糖純度分別為：木瓜蛋白酶(42.57±1.83)%，中性蛋白酶(57.00±3.08)%，堿性蛋白酶(52.40±0.47)%。

2.3 3種酶法除蛋白方法比較結(jié)果

由圖1可以看出，堿性蛋白酶處理后的PRA得率最高，為(7.47±1.08)%，中性蛋白酶最低，為(6.20±2.13)%；中性蛋白酶處理后的PRA的純度最高，為(57.00±3.08)%，其次是堿性蛋白酶，為(52.40±0.47)%。雖然中性蛋白酶處理后多糖的純度最高，但是標(biāo)準(zhǔn)差較大，沒有堿性蛋白酶穩(wěn)定，得率也偏低。綜合考慮，采用堿性蛋白酶純化蘆筍粗多糖。

圖1 不同除蛋白方法得率及純度比較Fig.1 Comparisons on recovery and purity of crude polysaccharides after hydrolysis with three enzymes

2.4 蘆筍多糖對DPPH自由基清除能力的測定

圖2 PRA對DPPH自由基的清除能力Fig.2 Concentration dependent scavenging activity of green asparagus polysaccharides against DPPH free radicals

由圖2可得，PRA質(zhì)量濃度0.125mg/mL時，開始顯示出清除DPPH自由基的能力((10.12±0.69)%)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，對DPPH自由基的清除率迅速增強(qiáng)；當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為1.5mg/mL時，清除率為50%，IC50=(1.50±0.75)mg/mL。當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為10mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到(86.11±1.32)%，顯示出較高的體外清除DPPH自由基的的活性。

2.5 蘆筍多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

圖3 PRA對O－2·的清除作用Fig.3 Concentration dependent scavenging activity of green asparagus polysaccharides against superoxide anion free radicals

該體系中鄰苯三酚在堿性條件下自氧化形成超氧陰離子自由基，該自由基又會促進(jìn)鄰苯三酚的自氧化，同時生成紅色中間產(chǎn)物。若待測物對鄰苯三酚自氧化有抑制作用，體系紅色變淺，即說明其對超氧陰離子自由基有清除作用。

結(jié)果如圖3所示，當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL時，開始顯示出對超氧陰離子自由基的清除能力((5.70±0.26)%)。隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，呈緩慢上升趨勢；當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為1mg/mL時，清除率達(dá)到最大，為(17.53±0.26)%，說明PRA具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力。2.6 蘆筍粗多糖對羥自由基(·OH)的清除作用

圖4 PRA對羥自由基的清除作用Fig.4 Concentration dependent scavenging activity of green asparagus polysaccharides against hydroxyl free radicals

H2O2和Fe2+混合后，可生成具有很高反應(yīng)活性的·OH。在體系中加入水楊酸后，能有效的捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510nm處有強(qiáng)吸收。若加入具有清除·OH作用的物質(zhì)，便會與水楊酸競爭，使有色產(chǎn)物生成量減少。

圖4顯示當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL時，對·OH的清除率為(8.03±1.14)%，隨著PRA質(zhì)量濃度的增加，其對·OH的清除能力增強(qiáng)，表明PRA對·OH的清除力與其質(zhì)量濃度具有一定的量效關(guān)系。當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為2.0mg/mL時，清除率達(dá)50%，即IC50=2.0mg/mL；PRA質(zhì)量濃度為5.0mg/mL時，對羥自由基清除率達(dá)到(81.83±0.43)%，體現(xiàn)了PRA良好的清除·OH的活性。

2.7 蘆筍多糖溶液對H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用

表3 PRA對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的影響(x±s,n=5)Table 3 Effect of green asparagus polysaccharides on rat erythrocyte hemolysis induced by H2O2 (x±s,n=5)

表4 PRA對大鼠線粒體腫脹度的影響(x±s,n=5)Table 4 Effect of green asparagus polysaccharides on swelling of rat liver mitochondria (x±s,n=5)

當(dāng)紅細(xì)胞中加入H2O2后，H2O2可與Fe2+結(jié)合產(chǎn)生·OH，·OH與H2O2均能導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生氧化損傷而產(chǎn)生溶血。表3顯示，隨著PRA質(zhì)量濃度的增加，對紅細(xì)胞溶血的抑制作用迅速增強(qiáng)。與對照組相比，低劑量PRA可顯著抑制氧化溶血現(xiàn)象的發(fā)生；當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為5mg/mL時，抑制率達(dá)到17.87%。PRA對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用在3個質(zhì)量濃度(2、5、10mg/mL)均達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)，顯示出較好的抑制紅細(xì)胞氧化溶血作用。

2.8 對大鼠肝線粒體腫脹度的影響

由表4可知，正常組在60min后，A520nm降幅為(5.53±1.89)%，模型組(Fe2+＋VC)A520nm降幅達(dá)(12.09±1.65)%。說明當(dāng)VC和Fe2+存在時，誘生的·OH可導(dǎo)致線粒體中不飽和脂肪酸的加速氧化，損壞線粒體的膜結(jié)構(gòu)，使線粒體通透性增加而產(chǎn)生腫脹，表現(xiàn)為A520nm值降低。1mg/mL PRA組的吸光度與模型組相比，無顯著性差異。中質(zhì)量濃度PRA(1、2mg/mL)組對線粒體腫脹的抑制作用明顯。當(dāng)PRA質(zhì)量濃度為5mg/mL和10mg/mL時，抑制作用極為顯著(P＜0.01)，說明其對線粒體具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)對蘆筍多糖的浸提條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明影響蘆筍粗多糖純度的因素主次順序?yàn)樘崛囟龋咎崛r間＞料液比＞提取次數(shù)。蘆筍多糖的最佳提取條件為提取溫度100℃、提取時間3h、料液比1:20(g/mL)，提取1次。比較木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶純化粗多糖的效果，結(jié)果表明，堿性蛋白酶處理后多糖的得率最高，為(7.47±1.08)%，純度為(52.40±0.47)%。

蘆筍多糖的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：PRA對O2－·的清除作用較弱，而對·OH和DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，抑制率分別為(81.83±0.43)%和(86.11±1.32)%，可能PRA清除O2－·和·OH、DPPH自由基的物質(zhì)基礎(chǔ)或作用機(jī)理有所不同。蘆筍多糖抑制紅細(xì)胞氧化溶血，肝線粒體腫大的作用亦及其顯著，表明其在大鼠血清、細(xì)胞、細(xì)胞器等水平上都有較好的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘆筍多糖可能對生物機(jī)體具有保健功效，本實(shí)驗(yàn)可為蘆筍多糖藥物與功能性食品的開發(fā)提供一定參考。

[1] 周利亙, 王春輝, 王君虹, 等. 蘆筍的活性成分及其生物學(xué)功能[J].安徽農(nóng)學(xué)通報, 2006, 12(2): 23-25.

[2] 孫春艷, 趙伯濤, 郁志方, 等. 蘆筍化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源, 2004, 23(5): 1-5.

[3] MABEL M J, SANGEETHA P T, HATEL K, et a1. Physicochemical characterization of fructooligosaccharides and evaluation of their suitability as a potential sweetener for diabetics[J]. Carbohyd Res, 2008, 343(1):56-66.

[4] KOO H N, JEONG H J, CHOI J Y, et al. Inhibition of tumor necrosis factor-α-induced apoptosis by Asparagus cochinchinensis in Hep G2 cells[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2000, 73(1/2): 137-143.

[5] 黃曉德, 趙伯濤, 錢燁, 等. 蘆筍莖葉多糖的提取純化研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2006, 18(1): 15-18.

[6] KAMAT J P, BOLOOR K K, DEVASAGAYAM T P A, et al. Antioxidant properities of Asparagus racemosus against damage induced by γradiation in rat liver mitochondria[J]. Journal of Ethnopharmacology,2000, 71(3): 425-435.

[7] JI Yubin, JI Chenfeng, CHEN Xuejun. Effects of asparagus polysaccharide on GPA and band 3 from erythrocyte membrane of S180 mice[J].IFMBE Proceeding, 2008, 19(13): 528-530.

[8] 臺建祥, 付勤, 梅慧生. 蘆筍罐頭生產(chǎn)中廢棄物的應(yīng)用研究[J]. 食品科學(xué), 1997, 18(3): 32-33.

[9] 許彬, 陳平. 竹節(jié)參粗多糖的初步純化工藝研究[J]. 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2008, 27(4): 5-7.

[10] SUN Zhongwei, ZHANG Lixiang, ZHANG Bin, et al. Structural characteristion and antioxidant properties of polysaccharides from the fruiting bodies of Russula virescens[J]. Food Chemistry, 2010, 118(3):675-680.

[11] 季宇彬, 陳學(xué)軍, 汲晨鋒. HPLC分析蘆筍多糖對荷瘤小鼠紅細(xì)胞的影響[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2006, 22(5): 1-3.

[12] 林肖惠, 劉鵬, 徐為人, 等. 牛膝不同炮制品中多糖的測定[J]. 中草藥, 2008, 39(8): 1180-1182.

[13] 仝瑛, 倪士峰, 劉建利, 等. DNS法測定菊芋中還原糖含量的研究[J]. 陜西中醫(yī), 2009, 30(11): 1535-1537.

[14] 李姣娟, 黃克瀛, 龔建良, 等. 油茶葉乙醇提取物清除DPPH自由基作用的研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2008, 28(2): 83-84.

[15] 嚴(yán)成, 嚴(yán)夏. 枸杞多糖提取工藝比較及體外抗氧化研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 184-185.

[16] 朱曉宦, 吳向陽, 仰榴青, 等. 馬齒莧粗多糖的提取及清除羥基自由基活性的能力[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版, 2007, 17(1): 58-59.

[17] 王官林, 田兵, 方宏筠, 等. 蘆薈抗氧化物質(zhì)活性及對紅細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2002, 24(4): 380-384.

[18] DUTRA F, BECHARA J H E. Aminoacetone induces iron-mediated oxidative damage to isolated rat liver mitochondria[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004, 430(2): 284-289.

[19] 張龍翔, 張庭芳, 李令媛. 生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 1997: 138-140.

Extraction, Purification and in vitro Antioxidant Effects of Polysaccharides from Green Asparagus (Asparagus officinalis)

LI Jiao，WANG Ke，WANG Rui-po，ZHAO Di，QU Wei-jing*
(College of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200062, China)

Objective: To optimize the extraction and purification process for polysaccharides from green asparagus (Asparagus officinalis) and to explore their in vitro antioxidant effects. Methods: Ethanol reflux extraction followed by enzymatic deproteinization was used to extract and purify polysaccharides from freshly picked green asparagus. A 9-run, 3-factor, 4-level orthogonal array design was applied to optimize temperature as well as extraction duration and number that influence extraction efficiency. The effects of temperature, hydrolysis duration and enzyme dose for polysaccharide deproteinization using papain, neutral protease or alkaline protease were explored based on a 9-run, 3-factor, 3-level orthogonal array design. Total sugar and reducing sugar were determined by phenol-sulphate and salicylic acid methods. Finally, the free radical scavenging effect of green asparagus polysaccharides and their inhibitory effect on erythrocyte hemolysis and swelling of liver mitochondria. Results: The once extraction at 100 ℃for 3 h with a solid/liquid ratio of 1:20 (g/mL) provided the highest extraction efficiency, (8.50± 1.07)%, and the purity of the resulting product was increased to (52.40 ± 0.47)% after optimized alkaline protease hydrolysis. Green asparagus polysaccharides could dramatically scavenge DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radicals, and inhibit erythrocyte hemolysis and liver mitochondrial swelling. Conclusion: Green asparagus polysaccharides have good antioxidant effects in vitro.

green asparagus polysaccharides；extraction；purification；antioxidant activity

R151.3；Q255

A

1002-6630(2011)08-0065-05

2010-05-22

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技發(fā)展基金項(xiàng)目(07DZ12043)

李姣(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橘Y源植物化學(xué)。E-mail：lucky.lijiao@gmail.com

*通信作者：瞿偉菁(1957—)，男，教授，本科，研究方向?yàn)橘Y源植物化學(xué)。E-mail：wjqu@bio.ecnu.edu.cn