二次柱層析制備高純度樹莓籽原花青素的工藝

張佰清，張艷艷，李龍杰

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

二次柱層析制備高純度樹莓籽原花青素的工藝

張佰清，張艷艷，李龍杰

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

為制備高純度樹莓籽原花青素，通過靜態(tài)吸附實驗從8種大孔吸附樹脂中篩選出HPD100C型樹脂對樹莓籽原花青素吸附量大、解吸率高，適合于樹莓籽原花青素的富集。通過動態(tài)吸附實驗得到其最佳吸附條件為上柱料液pH5、上柱速率0.5mL/min、40%乙醇以1.5mL/min的流速進行洗脫。將經(jīng)過大孔樹脂層析分離純化的原花青素粗品經(jīng)聚酰胺柱分離，60%乙醇洗脫得到的原花青素純度達92%，可得純度為57%的原花青素。

樹莓籽；原花青素；大孔吸附樹脂；聚酰胺

原花青素是廣泛存在于植物中的一類多酚物質(zhì)的總稱，是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素聚合而成[1-3]。原花青素具有水溶、無毒、無過敏、安全性好等特性，是一種天然的自由基清除劑和抗氧化劑，而且還有抗衰老、抗腫瘤、抗癌變、預防心腦血管疾病、預防動脈粥樣硬化等功能[4-6]。樹莓籽粗提物中含有多糖、蛋白等多種雜質(zhì)，且原花青素低聚體含量較低，需要進一步分離純化。大孔樹脂吸附法以投資少、選擇性好、操作簡便、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，在天然產(chǎn)物的提取分離中得到廣泛的應用[7-11]。本實驗對8種國產(chǎn)大孔吸附樹脂進行篩選，研究上樣質(zhì)量濃度、洗脫劑體積分數(shù)等工藝參數(shù)對原花青素的純化分離效果。根據(jù)初步研究和文獻資料[12-14]，發(fā)現(xiàn)用柱層析分離原花青素是一條比較好的工藝路線，尤其是聚酰胺柱層析和大孔樹脂柱層析的聯(lián)合使用，具有獨特的優(yōu)越性。本實驗以大孔樹脂分離的原花青素為原料，對大孔樹脂、聚酰胺二次柱層析制備高純度原花青素的工藝條件進行探索，旨在為高純度樹莓籽原花青素的分離制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D101、AB-8、HPD100C、HPD700、HPD750樹脂、聚酰胺 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；X-5、NKA-Ⅱ樹脂 天津海光化工有限公司；兒茶素 中國藥品生物制品檢定所；乙醇、鹽酸(均為分析純)；香草醛國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

THZ88-1臺式多用恒溫振蕩器 江蘇太倉鹿河生化儀器廠；RE-52A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DBS-100電腦全自動部分收集器、DHL-A電腦恒流泵、HD-3紫外檢測儀 上海滬西分析儀器廠；AL204型萬分之一天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-2000紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；真空干燥箱 天津實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 上柱液預處理

稱取100g脫脂樹莓籽，以1000mL 60%乙醇于60℃微波提取3min，重復3次。過濾后合并濾液，60℃、0.09MPa旋轉蒸發(fā)回收乙醇，鹽析法除去粗提液中的蛋白后，然后加入適量去離子水室溫靜置12h，濾去不溶物后用去離子水溶解并稀釋至一定質(zhì)量濃度，即得上柱液。

1.3.2 靜態(tài)吸附實驗

在100mL具塞錐形瓶中加入1g用無水乙醇浸泡4h預處理的不同型號樹脂和50mL原花青素水溶液，然后放入25℃恒溫水浴振蕩器中，120r/min振蕩24h。將樹脂與吸附后的原花青素水溶液分離，測定樣液的原花青素質(zhì)量濃度(mg/mL)，計算樹脂的吸附率。然后分別加入50mL 60%乙醇進行洗脫，測定洗脫液中原花青素的質(zhì)量濃度，計算各種樹脂的吸附量、解吸量和解吸率。

原花青素質(zhì)量濃度測定方法：香草醛-鹽酸法[15]。

式中：C0為吸附液初始質(zhì)量濃度/(mg/mL)；C1為吸附液平衡質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V0為吸附液初始體積/mL；V1為吸附液平衡時的體積/mL；m為樹脂質(zhì)量/g。

式中：C2為解吸后溶液的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V2為解吸后溶液體積/mL。

1.3.3 靜態(tài)吸附動力學

選取合適的樹脂，吸干其表面水分后，分別準確稱取lg置于150mL三角瓶中，各加入40mL樹莓籽原花青素提取液，置于恒溫搖床，25℃、120r/min振蕩，每隔30min取1mL溶液測定，連續(xù)測定12h，考察樹脂對原花青素的吸附量與時間的關系。

1.3.4 動態(tài)吸附-洗脫條件

1.3.4.1 上樣樣品pH值對動態(tài)吸附的影響

將提取液pH值依次調(diào)到2、3、4、5、6，吸附流速0.5mL/min，然后用水洗脫至洗脫液澄清透明后，用體積分數(shù)60%乙醇，以0.5mL/min流速洗脫，測定洗脫產(chǎn)物質(zhì)量濃度。

1.3.4.2 吸附流速對動態(tài)吸附的影響

用裝有HPD100C樹脂的層析柱對50mL PC提取液進行吸附，水洗至洗脫液為無色，以60%乙醇為洗脫溶劑，分別取吸附流速為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mL/min作比較，測定吸附率。

1.3.4.3 乙醇體積分數(shù)對動態(tài)吸附的影響

1.3.4.4 不同洗脫流速對洗脫效果的影響

用40%乙醇以0.5～2.5mL/min的不同流速洗脫，將洗脫液合并、濃縮、真空干燥，測定產(chǎn)物的解吸率。

1.3.5 聚酰胺柱純化

將上述大孔樹脂分離出的原花青素的干燥產(chǎn)物用水溶解后用聚酰胺柱分級，流動相依次為30%、40%、50%、60%、70%乙醇溶液。流速均為0.5mL/min。將不同流動相洗脫下來的組分分別收集，真空干燥后測定純度。

2 結果與分析

2.1 不同樹脂對原花青素吸附解吸的性能參數(shù)

選擇8種國產(chǎn)大孔吸附樹脂，研究其對樹莓籽原花青素的靜態(tài)吸附性能和解吸性能，以原花青素的吸附量和解吸率為指標，從中選出吸附量大、選擇性強、解吸率高的樹脂，結果參見表1。

2.片形吸蟲病。片形吸蟲病是寄生于黃牛、水牛、山羊、綿羊等各種反芻動物的肝臟膽管中的肝片形吸蟲和大片形吸蟲所引起。豬、馬屬動物及野生動物也可寄生，并且可寄生于人。牛羊片形吸蟲病在各國均流行。一般來說，適宜于蟲卵和幼蟲發(fā)育的季節(jié),也就是椎實螺大量繁殖的季節(jié),是片形吸蟲病的流行季節(jié)。我國南方年溫差較小,雨量充沛,所謂感染的高峰季節(jié)就不十分明顯，牛、羊一年四季放牧，常年均能感染，但以春、夏二季最為嚴重，秋季次之，冬季較少。

表1 8種樹脂對樹莓籽中原花青素的平衡吸附性質(zhì)Table 1 Absorption and desorption performance of 8 types of macroporous resins towards raspberry seed procyanidins

從表1可知，8種樹脂以HPD100C的吸附量最高，每克樹脂可以吸附12.48mg樹莓籽原花青素，AB-8和HPD700次之，分別為10.30mg/g和9.25mg/g。其中HPD100C具有最大吸附量和較高的解吸率，因而后續(xù)實驗選擇HPD100C進行。

2.2 靜態(tài)吸附動力學曲線

采用初始質(zhì)量濃度14mg/mL的葡萄籽提取液對樹脂HPD100C進行了靜態(tài)等溫吸附動力曲線研究，結果如圖1所示。

從圖1、2可以看出，HPD100C樹脂在吸附的起始階段對原花青素的吸附速度非?？欤瑢儆诳焖倨胶庑?，在1h內(nèi)吸附量可達7.96mg/g，基本已經(jīng)超過其總吸附量的60%，5h左右的吸附量11.52mg/g，超過總吸附量的90%。隨著吸附的進行，溶液中的原花青素含量的減少，以及樹脂自身吸附量已接近極限吸附量，曲線出現(xiàn)“平臺”。綜上所述，HPD100C吸附原花青素達到吸附終點的時間為300min。

圖1 HPD100C樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.1 Static adsorption curve of raspberry seed procyanidins on type HPD100C macroporous resin

圖2 HPD100C樹脂吸附量與時間關系曲線Fig.2 Time course of static adsorption of raspberry seed procyanidins on type HPD100C macroporous resin

2.3 動態(tài)吸附實驗

2.3.1 進樣液pH值對吸附率的影響

上柱速率為0.5mL/min、60%乙醇溶液洗脫，洗脫流速0.5mL/min，上樣液pH值對原花青素吸附率的影響見圖3。

圖3 進樣液pH值對吸附率的影響Fig.3 Effect of sample pH on the adsorption capacity of type HPD100C macroporous resin toward raspberry seed procyanidins

由圖3可以看出，當pH5時，原花青素的吸附率最高。這主要是因為原花青素為多羥基酚類，呈弱酸性，要達到較好的吸附效果必須在弱酸性或酸性條件下以氫鍵的方式被吸附。pH值的變化改變體系內(nèi)的分子作用力，從而影響分離效果。因此，選擇pH5進樣液進樣最佳。

2.3.2 吸附流速對吸附量的影響

進樣液pH5，測定不同吸附速率的動態(tài)吸附率，結果見圖4。

圖4 進樣流速對吸附率的影響Fig.4 Effect of sample loading flow rate on the adsorption capacity of type HPD100C macroporous resin toward raspberry seed procyanidins

從理論上講，上樣液的流速越慢，原花青素的吸附越充分，從而吸附率也越高。由圖4可以看出，流速不同，吸附量也有所變化。流速增大，HPD100C樹脂對原花青素的吸附量減小。當上柱流速為0.5mL/min時，HPD100C樹脂的動態(tài)吸附率為98%；當流速提高到1.25mL/min時，其動態(tài)吸附率降至83%。這是因為流速的變化直接影響溶質(zhì)向樹脂內(nèi)表面的擴散，從而影響吸附效果。隨著上柱流速增大，樹脂與料液中原花青素之間沒有足夠長的時間接觸，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂內(nèi)表面，造成樹脂的工作吸附量下降。在實際生產(chǎn)中應綜合考慮吸附量與工作效率選擇吸附速率，所以選用0.5mL/min左右的流速進行上柱。

2.3.3 洗脫劑體積分數(shù)的選擇

按實驗得出的吸附條件進行吸附后，控制解吸速率1.5mL/min，洗脫體積為2.0BV。不同體積分數(shù)乙醇對樹莓籽中原花青素的解吸情況見圖5。

圖5 洗脫劑體積分數(shù)對解吸率及純度的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate of raspberry seed procyanidins from type HPD100C macroporous resin

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分數(shù)的增加解吸率也提高。當乙醇體積分數(shù)為30%時，解吸率47.2%；而當乙醇體積分數(shù)提高到40%時，解吸率88.6%。此后，再增加乙醇體積分數(shù)，解吸率略有增加，但變化不明顯。而乙醇體積分數(shù)過高，生產(chǎn)成本增加，并且揮發(fā)性大，增加了控制操作條件的難度。因此選用40%的乙醇進行洗脫。

2.3.4 洗脫流速的選擇

圖6 洗脫流速對解吸率的影響Fig.6 Effect of desorptino flow rate on the desorption rate of raspberry seed procyanidins from type HPD100C macroporous resin

由圖6可以看出，隨著洗脫流速的加快，原花青素的解吸率呈下降趨勢，當洗脫流速加快到1.5mL/min時，下降趨勢更加明顯。對于一定量的洗脫液，如加快洗脫流速，則洗脫液與樹脂作用的時間縮短，那么在洗脫液對原花青素的溶解還未達到飽和時就已經(jīng)達到一種動態(tài)平衡，從吸附床上流出。因此就會還有一部分的原花青素吸附在樹脂上沒有被洗脫下來。由于在低流速狀態(tài)下，洗脫時間較長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此可以在不顯著影響原花青素的解吸率的條件下，適當?shù)募涌煜疵摿魉?。因此，宜選擇1.5mL/min的洗脫流速。

2.4 聚酰胺柱純化

經(jīng)大孔樹脂分離得到較低純度的原花青素樣品，需要經(jīng)過聚酰胺進一步純化，以得到較高純度的原花青素。將經(jīng)過大孔樹脂層析分離的原花青素用聚酰胺柱純化，流動相分別為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液。原花青素經(jīng)不同體積分數(shù)洗脫液洗脫效果見圖7。

圖7 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on the desorption rate of raspberry seed procyanidins from type HPD100C macroporous resin

圖7 顯示，當洗脫液中乙醇體積分數(shù)30%時，洗脫液的極性相對較大，幾乎不能洗脫下原花青素，當乙醇體積分數(shù)40%時，洗脫液極性仍然較大，被洗脫下來的原花青素增多；當增加到60%、70%時，可洗脫下來的原花青素達到最大值，且兩者相當。收集60%乙醇洗脫部分，測得純度是92%。

3 結 論

通過對8種樹脂吸附性能的篩選，得出HPD100C樹脂較適合精制原花青素粗提物，其最佳的柱分離條件為上樣液pH5、上樣液流速0.5mL/min、40%的乙醇溶液洗脫、洗脫液流速1.5mL/min，經(jīng)HPD100C樹脂吸附，原花青素的純度達到57%。以此純度的原花青素為原料，再用聚酰胺柱層析精制制備高純度的原花青素，得到92%高純度的原花青素。

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Preparation of High Purity Procyanidins from Raspberry Seeds by Two-step Resin Column Chromatography

ZHANG Bai-qing，ZHANG Yan-yan，LI Long-jie
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The purpose of the present study was to develop a two-step resin column chromatographic method for purifying crude procyanidin extract from raspberry seeds. Static adsorption and desorption experiments were carried out to comparatively investigate the adsorption and desorption performance of 8 types of macroporous resins towards raspberry seed procyanidins,and type HPD100C macroporous resin showed higher adsorption quantity and desorption rate and consequently was more suitable for enriching raspberry seed procyanidins. The optimal conditions for the dynamic adsorption and desorption of raspberry seed procyanidins on type HPD100C macroporous resin were experimentally determined as follows: sample pH 5,0.5 mL/min sample loading flow rate, and 1.5 mL/min desorption flow rate with 40% ethanol as desorption solvent. The pooled eluate obtained was applied to polyamide resin followed by desoprtion with 60% ethanol, and the resulting final purity of raspberry seed procyanidins was 92%.

raspberry seeds；procyanidins；macroporous resin；polyamide

TS201.1

A

1002-6630(2011)08-0163-04

2010-05-29

張佰清(1966—)，男，副教授，博士，主要從事食品科學與營養(yǎng)學研究。E-mail：sybaiqingxl@sina.com