藤茶中總黃酮的三波長(zhǎng)紫外光譜法測(cè)定

周大寨，朱玉昌，王 進(jìn)

(1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

藤茶中總黃酮的三波長(zhǎng)紫外光譜法測(cè)定

周大寨1，朱玉昌1，王 進(jìn)2

(1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

以乙醇為溶劑提取藤茶中總黃酮，用三氯化鋁作為顯色劑，采用三波長(zhǎng)紫外光譜法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，黃酮質(zhì)量濃度在0～40μg/mL內(nèi)，分別在波長(zhǎng)為λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm處測(cè)吸光度時(shí)，ΔA與質(zhì)量濃度C之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔA=0.0171C＋0.0171，相關(guān)系數(shù)r=0.9978。方法的回收率為98.18%～102.79%，變異系數(shù)小于0.371%，具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

藤茶；總黃酮；三波長(zhǎng)紫外光譜法

藤茶，學(xué)名為顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W. T. Wang]，為葡萄科(Vitaceae Michx)蛇葡萄屬(Ampelopsis)的一種野生木質(zhì)落葉藤本植物，屬典型類茶植物。藤茶中含有豐富的以二氫楊梅素為主的黃酮類成分，現(xiàn)代中藥藥理分析表明，這些黃酮類物質(zhì)具有增強(qiáng)免疫[1]、抗炎抗菌[2-3]、降血糖、降血脂[4-5]，抗氧化[6-7]等保健功效。

近年來(lái)藤茶中總黃酮含量測(cè)定的方法以光譜法[8-9]和色譜法[10-11]為主。色譜法分離效果好，但定性難，且操作較為繁瑣，所需實(shí)驗(yàn)材料及儀器較為嚴(yán)格。光譜法操作步驟簡(jiǎn)單，分析速度快，且實(shí)驗(yàn)條件一般實(shí)驗(yàn)室均能達(dá)到，已成為定量定性分析較為普遍的方法?；谀壳把芯繜衢T的三波長(zhǎng)光譜法能有效地消除吸收峰不對(duì)稱給定量分析造成的影響，并校正基于干擾組分的吸收光譜具有可能是散射造成的背景產(chǎn)生的基線傾斜，本實(shí)驗(yàn)擬建立定量藤茶中總黃酮的三波長(zhǎng)光譜法，為建立適合藤茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的判斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶由恩施來(lái)鳳縣向班貴藤茶有限公司提供，干燥后粉碎，過(guò)100目篩，裝瓶備用。

丙酮(AR)、95%乙醇(AR)、三氯化鋁(AR)、98%二氫楊梅素樣品(色譜純)，實(shí)驗(yàn)所用水均為二重蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

BT224S型電子天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)； HSW12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 方法原理[12]

三波長(zhǎng)分光光度法的基本原理如圖1所示。在吸收光譜曲線上，用作圖法適當(dāng)?shù)剡x擇3個(gè)波長(zhǎng)λ1、λ2、λ3，并在這3個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1、A2、A3。

圖1 三波長(zhǎng)光譜法的基本原理示意圖[12]Fig.1 Principle of three-wavelength spectrophotometric method

式中：ε為待測(cè)組分在各波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)；b為光程；c為待測(cè)組分的濃度。由公式(1)可知，ΔA值與待測(cè)組分的濃度成正比，可用于對(duì)待測(cè)組分的測(cè)定。從圖1可知，在所選擇的3個(gè)波長(zhǎng)處，如果相應(yīng)的吸收光譜曲線上的3點(diǎn)在一條直線上，則測(cè)得的ΔA值為零，而當(dāng)干擾成分產(chǎn)生的吸收光譜為一條直線時(shí)，則按上述方法選擇3個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)得到的ΔA值與干擾成分的濃度無(wú)關(guān)，因此三波長(zhǎng)光譜法有效地消除了吸收峰不對(duì)稱給定量分析造成的影響，提高了定量分析的準(zhǔn)確度。1.3.2 藤茶中總黃酮的提取

圖2 藤茶提取液與二氫楊梅素對(duì)照品的吸收光譜Fig.2 Comparison of UV absorption spectra of Ampelopsis grossedentata extract and dihydromyricetin standard

稱取藤茶干粉1.5g，用濾紙包好，置于索氏提取裝置中，在燒瓶中裝入適量石油醚，50℃水浴鍋回流2～3h，回收石油醚，向燒瓶中再加入95%乙醇溶液約250mL，90℃水浴提取5～6h，收集提取液，95%乙醇定容至250mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

準(zhǔn)確吸取二氫楊梅素儲(chǔ)備液1.0mL注入10mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%三氯化鋁溶液3mL，95%乙醇溶液充分混合至刻度，以未加測(cè)定物的95%乙醇溶液做參比，在波長(zhǎng)250～400nm范圍內(nèi)掃描，繪制其吸收曲線(圖3)。二氫楊梅素的最大吸收波長(zhǎng)為311nm，其他雜質(zhì)在此波長(zhǎng)處也有一定的吸收，在二氫楊梅素的紫外吸收曲線上先選擇296nm和262nm兩個(gè)波長(zhǎng)，連接這兩點(diǎn)交于322nm波長(zhǎng)附近，在這3個(gè)波長(zhǎng)處，二氫楊梅素的ΔA值較大，而雜質(zhì)的ΔA值幾乎等于零，因此以296、311、322nm為三波長(zhǎng)法定量測(cè)定藤茶中總黃酮的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖3 三波長(zhǎng)的確定Fig.3 Optimum wavelengths for flavonoid determination

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為130μg/mL二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分別注入10mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的三氯化鋁溶液3mL，95%的乙醇溶液充分混合至刻度，在λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm分別測(cè)得吸光度，按公式(1)計(jì)算ΔA，求得ΔA與質(zhì)量濃度關(guān)系的回歸方程為ΔA=0.0171C＋0.0171，相關(guān)系數(shù)r=0.9978，說(shuō)明黃酮質(zhì)量濃度在0～40μg/mL內(nèi)，分別在波長(zhǎng)為λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm處測(cè)吸光度時(shí)，ΔA與質(zhì)量濃度C之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3 回收率和方法精密度實(shí)驗(yàn)

按上述實(shí)驗(yàn)方法制備4個(gè)不同濃度梯度的樣品，分別加入2個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定ΔA，求得其平均回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，結(jié)果見表1、2。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Spike recovery of the method

表2 精密度實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 2 Precision of the method (n=5)

由表1、2可以看出，本法的回收率為98.18%～102.79%，變異系數(shù)小于0.371%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均較高。由于ΔA值與黃酮的質(zhì)量濃度呈正比，在所選擇的3個(gè)波長(zhǎng)處，其相應(yīng)的吸收光譜曲線上3點(diǎn)在一條直線上，有效地消除了本底漂移及吸收峰不對(duì)稱給定量分析造成的影響，因此三波長(zhǎng)紫外光譜法為測(cè)定藤茶中總黃酮含量提供了更準(zhǔn)確可行的方法。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

用與繪制吸收曲線相同的方法配制樣品，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，樣品在室溫放置24h，測(cè)得其吸光度基本不變(圖4)。

圖4 黃酮穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Stability of the method

2.5 藤茶中總黃酮含量的測(cè)定

表3 藤茶中總黃酮含量測(cè)定Table 3 Results of determining total flavonoid contents in Ampelopsis grossendentata by the method

吸取藤茶提取液0.1mL置于10mL容量瓶中，按上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，計(jì)算ΔA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量，分析結(jié)果見表3。有關(guān)藤茶總黃酮的報(bào)告中含量最高為44%[13]，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的總黃酮得率高于文獻(xiàn)報(bào)道值，這可能與原料來(lái)源、提取及分析方法不同有關(guān)。

3 討 論

隨著對(duì)藤茶化學(xué)成分、藥理功能研究的深入[14]，對(duì)藤茶進(jìn)行大規(guī)模的開發(fā)與利用也在同步進(jìn)行[15-16]。鑒于該植物有不同的產(chǎn)地、不同的品種、采摘有不同的季節(jié)，而不同來(lái)源的材料其有效成分的含量與組成不一。為建立一個(gè)統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以其中黃酮類化合物的含量作為一個(gè)衡量指標(biāo)是最合理且最簡(jiǎn)便的。

在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，三波長(zhǎng)光譜法優(yōu)于單波長(zhǎng)光譜法體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是三波長(zhǎng)光譜法選取了干擾組分吸收曲線上吸光度位于同一直線上的3個(gè)點(diǎn)作為測(cè)試波長(zhǎng)，不但消除了干擾組分的干擾，而且對(duì)于基線平行的零次曲線或成一條直線的一次曲線均有抗干擾作用，其抗干擾能力較單波長(zhǎng)光譜法更佳[17]；二是基于特定的ΔA計(jì)算公式，在對(duì)定量信息ΔA的貢獻(xiàn)上，吸收曲線坡度平坦從而測(cè)量誤差小的吸收峰處的吸光度貢獻(xiàn)大些，權(quán)重系數(shù)大，吸收曲線坡度較陡處的吸收度貢獻(xiàn)小些，權(quán)重系數(shù)小，這樣，從誤差的傳遞上弱化了大誤差的影響，保障了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。由此，可得出結(jié)論：三波長(zhǎng)光譜法較單波長(zhǎng)光譜法測(cè)定藤茶中總黃酮含量，可信度、準(zhǔn)確度更高，可作為控制藤茶質(zhì)量的一種新方法。

[1] 鐘正賢, 周桂芬, 陳學(xué)芬, 等. 廣西藤茶中雙氫楊梅樹皮素保肝作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技, 2002, 9(3): 155-156.

[2] 崔曉燕, 王剛. 藤茶提取物的抗炎作用研究[J]. 中華實(shí)用中西醫(yī)雜志, 2007, 20(17): 1473-1475.

[3] 劉勝貴, 張祺麟, 李娟. 顯齒蛇葡萄提取物體外抑菌試驗(yàn)的研究[J].氨基酸生物與資源, 2006, 28(12): 12-14.

[4] 李玉山. 恩施藤茶對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝的影響[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 23(2): 7-9.

[5] 李玉山, 譚志鑫, 李田. 藤茶對(duì)大鼠高血脂和心肌酶的影響[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2006, 28(6): 506-509.

[6] TAN Gaoyi, ZHANG Minhong, FENG Jinghai. Effects of pretreatment by the flavanol ampelopsin on porcine kidney epithelial cell injury induced by hydrogen peroxide[J]. Agricultural Sciences in China, 2010,9(4): 598-604.

[7] 伍楊. 鳳鳴藤茶抗氧化作用的研究[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2006, 23(3): 14-15.

[8] 朱炯波, 張敏, 龔竹瓊, 等. 熒光分析法測(cè)定顯齒蛇葡萄中總黃酮的含量[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2005, 21(2): 155-157.

[9] 熊皓平, 楊偉麗, 何國(guó)慶, 等. 分光光度法測(cè)定顯齒蛇葡萄總黃酮含量[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(2): 144-145.

[10] 何桂霞, 裴剛, 周天達(dá), 等. 薄層掃描法測(cè)定藤茶中二氫楊梅素的含量[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志, 2000, 17(4): 275-277.

[11] 鄭虹, 葉秋. 高效液相色譜法測(cè)定藤茶素片中二氫楊梅素的含量[J].海峽藥學(xué), 2006, 18(3): 67- 69.

[12] 李明靜, 張衛(wèi), 趙東保, 等. 三波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定黑沙蒿中的總黃酮[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室, 2007, 26(3): 99-102.

[13] 何桂霞, 裴剛, 周天達(dá), 等. 顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2000, 25(7): 423-425.

[14] 陳玉瓊. 藤茶中黃酮, 二氫楊梅素的提取分離, 降血脂作用及藤茶安全評(píng)價(jià)的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[15] 張學(xué)娟. 藤茶的形態(tài)學(xué), 生物學(xué)特性及主要化學(xué)成分研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[16] 曾維超. 藤茶加工新工藝的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[17] 鞠興榮, 袁建, 汪海峰. 三波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定大豆異黃酮含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2001, 22(5): 46-48.

Determination of Total Flavonoids in Ampelopsis grossedentata by Three-wavelength UV Spectrophotometry

ZHOU Da-zhai1，ZHU Yu-chang1，WANG Jin2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Enshi 445000, China；2. School of Biological Science and Technology, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

A three-wavelength UV spectrophotometric method was proposed for the determination of total flavonoid content in Ampelopsis grossedentata. Samples were extracted with ethanol, and the extract was then detected colorimetrically with aluminum chloride as chromogenic agent at the wavelengths of 322, 311 nm and 296 nm. The regression equation of the proposed method was obtained as follows: ΔA = 0.0171C＋0.0171, which exhibited good linearity in the range of 0 to 40μg/mL, with a correlation coefficient r of 0.9978. The spike recoveries at two spiked levels were between 98.18% and 102.79%, and the precision RSDs (n = 5) were less than or equal to 0.371%. Thus, this method is accurate and precise.

Ampelopsis grossedentata；flavonoids；three-wavelength UV spectrophotometry

O657.3

A

1002-6630(2011)08-0235-03

2010-06-25

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009CDA155)；武漢市科技攻關(guān)項(xiàng)目(200920322147)；湖北省教育廳B類項(xiàng)目(B20101906)

周大寨(1976—)，男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物及其開發(fā)。E-mail：sws0048@163.com