徐定華，朱文學(xué)*

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化懷地黃中梓醇提取工藝

徐定華，朱文學(xué)*

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

目的：優(yōu)化回流輔助提取懷地黃中的梓醇工藝。方法：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，以梓醇的提取得率為響應(yīng)值，通過(guò)回歸分析各工藝參數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系，并由此預(yù)測(cè)最佳的工藝條件。結(jié)果：回流提取的最佳條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)72.94%、提取溫度54.8℃、料液比(g/mL)1:18.7、提取時(shí)間3.0h。該條件下提取2次，梓醇的提取得率達(dá)到3.513%。結(jié)論：響應(yīng)面法優(yōu)化回流輔助提取懷地黃中梓醇的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確、方便，所得的最佳提取工藝條件高效、可行。

懷地黃(Rehmannia glutinosaLibosch)為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊根，始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國(guó)著名的“四大懷藥”之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)它在中藥處方中的使用頻率排名處于前10位[1-2]。根據(jù)入藥形式及藥效的差異，可將地黃分為鮮地黃、生地黃、熟地黃。

梓醇是一種環(huán)烯醚萜苷類(lèi)物質(zhì)，是鮮地黃及生地黃的主要有效成分之一，具有利尿、緩瀉、降血糖、保肝、保護(hù)神經(jīng)、抗肝炎病毒以及抗癌及抗衰老等多種藥理活性[3-6]。目前，梓醇多是從天然植物中提取經(jīng)高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)純化而制得[7]，生產(chǎn)成本較高，還沒(méi)有規(guī)模生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道。由于梓醇化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定[8]，易受酸堿[9-10]等條件影響，提取比較困難。在懷地黃產(chǎn)地，通常是選取比較粗大的塊根經(jīng)烘焙制成生地黃及炮制成熟地黃作為藥用[11]，而細(xì)小和破碎部分由于沒(méi)有烘焙價(jià)值，大部分都棄掉，造成了資源的巨大浪費(fèi)。因此本實(shí)驗(yàn)擬在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)對(duì)懷地黃梓醇提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以期為地黃的綜合開(kāi)發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷地黃 河南省溫縣趙堡鄉(xiāng)軍地灘村懷地黃種植基地。

梓醇標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：20085118) 中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、磷酸(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純) 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent 1100型紫外檢測(cè)器、DAD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站 美國(guó)Agilent公司；FA1004型分析天平(萬(wàn)分之一) 上海市上平儀器公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峽予華儀器廠；FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；平行蒸發(fā)儀 廣州尚準(zhǔn)儀器有限公司；旋渦式樣品混合器 美國(guó)ABSON公司；101A-2型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梓醇 HPLC法檢測(cè)

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：C18柱(Hypersil，250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(1:99)；流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.3.1.2 梓醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0041g梓醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，搖勻，得0.41mg/mL標(biāo)品儲(chǔ)備液。再?gòu)拇藘?chǔ)備液中取5mL，在平行蒸發(fā)儀上濃縮至干，用流動(dòng)相復(fù)溶。準(zhǔn)確吸取該對(duì)照品液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用流動(dòng)相定容于1mL樣品瓶中。

上述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以1.3.1.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以梓醇含量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：Y＝3.3696X＋0.1088，R2＝ 0.9995。

1.3.2 樣品處理及含量測(cè)定

將鮮懷地黃切成2～3mm小塊，磨碎，過(guò)100目篩，精密稱(chēng)定篩下物2.00g于平底燒瓶中，加80%甲醇40mL，于50℃水浴回流提取2h，過(guò)濾；將濾渣轉(zhuǎn)移至平底燒瓶中，加80%甲醇40mL，同上法操作，合并續(xù)濾液，定容到100mL容量瓶中。精密吸取上液20mL，減壓濃縮，揮去溶劑，用流動(dòng)相復(fù)溶，定容至5mL；用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜測(cè)定含量。根據(jù)測(cè)得的峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中梓醇含量，用下式可得到懷地黃梓醇的提取得率。此鮮懷地黃的濕基含水率為72.39%。

式中：W為地黃梓醇提取得率/%；m為樣品中梓醇含量；F為稀釋因子；G為懷地黃干粉的質(zhì)量。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

回流提取過(guò)程中主要影響因素有溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液料比和提取時(shí)間等。為了考察各因素對(duì)提取效果的影響，以溶劑體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%、80%、100%)、提取溫度(30、40、50、60、70℃)、料液比(g/mL)(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)和提取時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)作為考察因素，以W作為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.2 懷地黃梓醇提取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時(shí)間為考察變量，分別用A、B、C、D表示，以W為響應(yīng)值，采用4因素5水平響應(yīng)面分析方法求取優(yōu)化的工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑和提取次數(shù)的確定

根據(jù)梓醇的性質(zhì)，選擇提取梓醇最常用的乙醇、甲醇、水3種溶劑，在60℃水浴上回流提取2次，每次2h的條件下，分別測(cè)定梓醇的提取得率。試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇體系的提取得率遠(yuǎn)高于乙醇和水體系的提取，故選用甲醇做提取溶劑。

用甲醇做提取溶劑，在60℃水浴上分別對(duì)同一懷地黃樣品提取1、2、3次，結(jié)果表明，提取2次的得率遠(yuǎn)高于提取1次的，而和提取3次的差別不大，綜合考慮成本等因素，本試驗(yàn)確定提取次數(shù)為2次。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)

稱(chēng)取2.00g磨碎的鮮懷地黃樣品，調(diào)節(jié)料液比為1:20，分別用20%、40%、60%、80%、100%甲醇在50℃水浴回流提取2h，同法提取2次，結(jié)果如圖1所示。

圖1 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.1 Effect of methanol concentration on catalpol extraction yield

由圖1可知，隨著溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，W增大，當(dāng)溶劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，W達(dá)到最大；主要是因?yàn)榧状俭w積分?jǐn)?shù)不同，極性不同，故梓醇的溶出率不同；溶劑體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，W開(kāi)始減小，因此選定在60%～100%區(qū)間內(nèi)作響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.2 提取溫度

稱(chēng)取2.00g磨碎的鮮懷地黃樣品，調(diào)節(jié)料液比為1:20，用80%的甲醇分別在30、40、50、60、70℃水浴上回流提取2h，同法提取2次，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.2 Effect of temperature on catalpol extraction yield

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，W增大，溫度從40℃升到50℃時(shí)，W明顯增大；隨著溫度的進(jìn)一步升高，W下降，說(shuō)明梓醇是一種熱敏性物質(zhì)，在高溫下不穩(wěn)定。因此選定在40～60℃區(qū)間內(nèi)作響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.3 料液比

稱(chēng)取2.00g磨碎的鮮懷地黃樣品，調(diào)節(jié)料液比為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，用80%甲醇分別在50℃水浴上回流提取2h，同法提取2次，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on catalpol extraction yield

由圖3可以看出，隨著提取溶劑用量的增大，W增大，料液比從1:15到1:20時(shí)，W明顯增大；提取溶劑用量繼續(xù)增大時(shí)，W升高不明顯，綜合考慮提取成本等因素，選定在1:10～1:30區(qū)間內(nèi)作響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.4 提取時(shí)間

稱(chēng)取2.00g磨碎的鮮懷地黃樣品，調(diào)節(jié)料液比為1:20，用80%甲醇分別在50℃水浴上分別回流提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，W增大，提取時(shí)間從2.0h增長(zhǎng)到3.0h時(shí)，梓醇提取得率明顯增大；可能是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)短，梓醇還未充分溶出；提取時(shí)間繼續(xù)增長(zhǎng)時(shí)，W升高不明顯，因此選定在1.5～3.5h區(qū)間內(nèi)作響應(yīng)面優(yōu)化。

圖4 提取時(shí)間對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on catalpol extraction yield

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述單因素分析結(jié)果，以上面4個(gè)因素為自變量，以梓醇提取得率(Y)為響應(yīng)值，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案[12]和結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 懷地黃梓醇提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼值Table 1 Factors and their coded levels in Box-Behnken experimental design

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用SAS9.2軟件[13]對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸分析，得到懷地黃中梓醇的提取得率與回流提取各因素變量間的函數(shù)關(guān)系為：Y=3.493571－0.034625A＋0.108125B＋0.018708C＋0.040458D－0.006813AB＋0.000812AC－0.024812AD－0.015813BC＋0.023312BD＋0.009687CD－0.047632A2－0.058882B2－0.090132C2－0.042632D2。

對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。

由表3可知，4個(gè)一次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平。由F值可知，各因素對(duì)W的影響次序?yàn)椋築＞D＞A＞C。從表3的分析結(jié)果來(lái)看，整體模型的P值小于0.0001，表明該二次方程模型達(dá)到極顯著水平。二次項(xiàng)及交互項(xiàng)中的AD、BC、BD均表現(xiàn)出顯著水平。回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該模型回歸極顯著，并且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好[14-16]。

表2 懷地黃梓醇提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of the established regression equation

2.3.3 響應(yīng)面分析

固定水平：料液比1:20；提取時(shí)間2.5h。

圖6 溶劑體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.6 Response surface plot slowing the effects of methanol concentration and solid-to-liquid ratio on liquid on catalpol extraction yield

圖7 溶劑體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.7 Response surface plot slowing the effects of methanol concentration and extraction time on catalpol extraction yield

為了考察交互項(xiàng)對(duì)梓醇提取得率的影響，在其他因素條件固定不變的情況下，考察交互項(xiàng)對(duì)提取得率的影響，對(duì)模型進(jìn)行降維分析。經(jīng)SAS9.2軟件分析，所得的響應(yīng)面分析圖見(jiàn)圖5～10。響應(yīng)面分析圖直觀地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。

由圖5～10可知，隨著各因素量的增大，響應(yīng)值增大；當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素量的增大，響應(yīng)值逐漸減??；在交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響中，溶劑體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、提取溫度與料液比、提取溫度與提取時(shí)間對(duì)W的影響較顯著。另外，由圖5～10可知該模型在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

圖8 提取溫度與料液比對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.8 Response surface plot slowing the effects of temperature and solid-to-liquid ratio on catalpol extraction yield

圖9 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.9 Response surface plot slowing the effects of extraction temperature and time on catalpol extraction yield

圖10 料液比與提取時(shí)間對(duì)梓醇提取得率的影響Fig.10 Response surface plot slowing the effects of solid-to-liquid ratio and extraction time on catalpol extraction yield

2.3.4 響應(yīng)面分析

為進(jìn)一步確定提取工藝最佳點(diǎn)，對(duì)擬合的回歸方程分別求4個(gè)變量的一階偏導(dǎo)，聯(lián)立方程組。對(duì)上方程組求解，并結(jié)合響應(yīng)面圖中的評(píng)價(jià)，可得到懷地黃中梓醇最佳提取工藝參數(shù)為：甲醇體積分?jǐn)?shù)72.94%、提取溫度54.8℃、料液比1:18.7、提取時(shí)間3.0h，在此最佳工藝條件下懷地黃梓醇理論提取得率為3.513%?？紤]到可操作性，在提取條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)73%、提取溫度55℃、料液比1:19、提取時(shí)間3.0h時(shí)，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到懷地黃梓醇的提取得率為3.509%，與理論值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化懷地黃梓醇的提取工藝可行。

3 結(jié) 論

在懷地黃梓醇的提取體系中，選擇甲醇為提取溶劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對(duì)回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出較優(yōu)工藝條件：甲醇體積分?jǐn)?shù)72.94%、提取溫度54.8℃、料液比1:18.7、提取時(shí)間3.0h。在較優(yōu)的提取條件下，懷地黃梓醇的提取得率可達(dá)到3.509%。并得到回流提取工藝中各因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合較好，有一定應(yīng)用價(jià)值。

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Response Surface Methodology as an Approach to Optimize Catalpol Extraction fromRadix Rehmannia glutinosa

XU Ding-hua，ZHU Wen-xue*
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Objective: To optimize the process parameters of solvent reflux extraction of catalpol fromRadix Rehmannia glutinosa. Methods: On the basis of one-factor-at-a-time experiments, response surface methodology (RSM) was used for process parameter optimization. A regression model was established describing catalpol extraction yield as a response to various process parameters. Results: The optimal extraction conditions were 72.94% methanol aqueous solution as the extraction solvent,extraction temperature 54.8 ℃, extraction time 3.0 h and number of repeated extractions 2. Under these conditions, the catalpol extraction yield was 3.513%. Conclusion: The established regression model can accurately and conveniently predict catalpol extraction yield. The optimal extraction process obtained is efficient and feasible.

Rehmannia glutinosaLibosch；catalpol；extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0062-05

2010-10-21

徐定華(1978—)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail：xudinghua2008@126.com

*通信作者：朱文學(xué)(1967—)，男，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品與中草藥加工研究。E-mail：zwx@mail.haust.edu.cn