李路易，梁冬雨，易清清，沙爽，史俊峰，梁鵬晨，常慶，4

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海 201203；2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)教育與研究中心，上海 201800；3.上海健康醫(yī)學(xué)院分子影像學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201318；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨脆性增加、骨量減少為特征并與年齡相關(guān)的全身性骨骼疾病，為最多發(fā)骨病[1]。其病理原因主要是由于“骨形成-骨吸收”平衡紊亂，骨吸收量大于骨形成量[2]。因此，目前用于骨質(zhì)疏松癥的臨床治療分為兩類：抑制破骨細(xì)胞功能的抗吸收劑和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞骨形成的合成代謝劑[3]。

目前，骨質(zhì)疏松癥的藥理學(xué)研究大都集中在抗骨吸收上，但抗骨吸收治療可以防止骨骼結(jié)構(gòu)的喪失卻不能恢復(fù)骨量及結(jié)構(gòu)[4]。并且雙膦酸鹽等抗吸收藥物在長期使用后會(huì)產(chǎn)生骨壞死和腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加等副作用[5-6]。此外，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的合成代謝劑甲狀旁腺激素價(jià)格昂貴，臨床使用時(shí)管理困難，因其量過多時(shí)將導(dǎo)致完全相反的作用[7-8]。因此，迫切需要找到一種新的有效的合成代謝劑來治療骨質(zhì)疏松癥。

地黃(Rehmannia glutinosa)為玄參科多年生草本植物地黃塊根，其主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類和糖類。其中環(huán)烯醚萜類化合物以梓醇含量最高，是《中華人民共和國藥典》2015年版中地黃的定性指標(biāo)[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，地黃具有降血糖、抗腫瘤和抗抑郁等功效，對(duì)梓醇的研究發(fā)現(xiàn)它可以重現(xiàn)地黃的藥理作用[10]。近年來，關(guān)于地黃治療骨質(zhì)疏松的報(bào)道日益增多，且以地黃為主的復(fù)方具有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性[11]，為了進(jìn)一步探討地黃的抗骨質(zhì)疏松機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)使用提取的地黃主要活性成分梓醇，采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，檢測分析不同濃度的梓醇對(duì)小鼠成骨細(xì)胞株增殖、分化和礦化的影響。

1 材料與儀器

1.1藥物 梓醇購買于成都睿斯思生物科技有限公司(批號(hào)：Z-005-180315)，純度大于99%。稱取梓醇200 mg，溶解于50 mL α-MEM(α-minimum Eagle’s medium)完全培養(yǎng)基中，0.22 μm過濾分裝，配制成為4000 mg·L-1的母液，4 ℃保存?zhèn)溆?，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要加入相應(yīng)體積或稀釋體積。

1.2試劑 低糖α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào)：SH30265.01)，胎牛血清(Gibco，批號(hào)：16140-071)，胰酶(Amresco，批號(hào)：1928609)，二甲基亞砜(Sigma，批號(hào)：D2650)，CCK8(東仁化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：CK04)，茜素紅(Sigma，批號(hào)：A5533)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：059-2-2)，PrimeScripTMRT reagent Kit(Takara，批號(hào)：RR037A)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Takara，批號(hào)：RR820A)。

1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma，311)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，SJCJ-1FD)，普通光學(xué)顯微鏡(Leica，ICC50W)，倒置相差顯微鏡(Leica，DMi8)，Model 680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad，1510)，可調(diào)式移液器(Eppendorf，4921)，培養(yǎng)板(Costar，024)，高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(Roche，Z480)。

2 方法

2.4梓醇對(duì)MC3T3-E1成骨關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 檢測梓醇對(duì)Runx2(runtrelatedtranscriptionfactor2)，Bglap(bonegammacarboxyglutamateprotein)，Col1a1(collagentypeIalpha1chain)的mRNA表達(dá)的影響，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以1×106cells·mL-1密度接種到6孔板中，待細(xì)胞周期同步化后，加入配好的(200，500 mg·L-1)梓醇培養(yǎng)3 d，空白對(duì)照組僅加入α-MEM完全培養(yǎng)液作為對(duì)照(記為0 mg·L-1)。當(dāng)細(xì)胞匯合至90%以上時(shí)，用Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA并及時(shí)按照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板配制20 μL的反應(yīng)體系，引物序列見表1。使用Roche LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按說明書進(jìn)行測定。最后使用最大二階倒數(shù)法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1梓醇不促進(jìn)MC3T3-E1的增殖 通過CCK8檢測分析不同濃度梓醇對(duì)MC3T3-E1增殖的影響，不同濃度(1，10，100，500，800，1 000，2 000，4 000 mg·L-1)梓醇溶液在1，3，6 d培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞的增殖沒有產(chǎn)生影響，同時(shí)在4 000 mg·L-1高濃度的藥物使用量時(shí)仍未抑制其增殖，提示梓醇對(duì)MC3T3-E1增殖未產(chǎn)生影響，并無細(xì)胞毒性。見圖1。

3.2梓醇促進(jìn)MC3T3-E1 ALP的分泌 為觀察梓醇促進(jìn)對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響，采用氨基安替吡啉測酚法檢測分析不同濃度梓醇對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP分泌的影響。檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)4 d時(shí)，梓醇在低濃度時(shí)(<500 mg·mL-1)對(duì)MC3T3-E1 ALP的分泌無顯著促進(jìn)作用，當(dāng)梓醇濃度>500 mg·L-1的時(shí)候顯著促進(jìn)了MC3T3-E1 ALP的分泌。繼續(xù)培養(yǎng)8 d后，低濃度梓醇對(duì)ALP的分泌仍無顯著作用，而高濃度梓醇促進(jìn)了ALP分泌，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

3.3梓醇促進(jìn)了MC3T3-E1礦化 根據(jù)圖2的分析結(jié)果，進(jìn)一步通過ARS檢測500 mg·L-1梓醇對(duì)MC3T3-E1礦化的影響。梓醇促進(jìn)MC3T3-E1礦化如圖3和4所示。圖3顯示在未加成骨誘導(dǎo)液只加500 mg·L-1梓醇情況下誘導(dǎo)21 d后，梓醇促進(jìn)了鈣鹽的沉積，并形成的鈣結(jié)節(jié)。圖4顯示在加了成骨誘導(dǎo)液的情況下，添加500 mg·L-1梓醇可以進(jìn)一步促進(jìn)鈣鹽的沉積和鈣結(jié)節(jié)的形成，說明梓醇促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞的礦化。白色尖頭指示為鈣結(jié)節(jié)，標(biāo)尺長度為10 μm。

3.4梓醇促進(jìn)成骨分化關(guān)鍵性基因的表達(dá) 據(jù)以上結(jié)果，進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測500 mg·L-1梓醇促進(jìn)了成骨分化關(guān)鍵性基因表達(dá)的影響，結(jié)果如圖5所示，梓醇在500 mg·L-1濃度時(shí)顯著性促進(jìn)了3種基因的表達(dá)(①P<0.05，②P<0.001)，這3種基因?yàn)槌晒欠只V化的關(guān)鍵性基因[11]。

4 討論

地黃的抗骨質(zhì)疏松作用已在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中得到了部分證實(shí)[11]。梓醇是地黃的主要成分，其對(duì)改善骨質(zhì)疏松的作用及安全和有效濃度仍有待研究。本研究使用小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1在體外模擬梓醇作用下的成骨分化過程，通過檢測不同濃度梓醇對(duì)成骨細(xì)胞增殖和成骨分化的影響，分析梓醇促成骨分化的安全和有效劑量。CCK8檢測結(jié)果提示，即使在很高的濃度下，梓醇對(duì)細(xì)胞沒有出現(xiàn)抑制作用，表現(xiàn)出很好的安全性。不同濃度的梓醇在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均無明顯促進(jìn)作用，這與經(jīng)典的促成骨誘導(dǎo)因子BMP2(bone morphogenetic protein 2)有很大的差異。BMP2在成骨過程中對(duì)細(xì)胞的增殖和分化均有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用[12]?？紤]到老年骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制以骨量的丟失為主，BMP2強(qiáng)烈的促成骨作用可能導(dǎo)致骨硬化，造成新的骨折風(fēng)險(xiǎn)。梓醇溫和的誘導(dǎo)成骨分化和礦化作用并不依賴細(xì)胞數(shù)量的變化，對(duì)改善老年骨質(zhì)疏松癥具有較好的安全性。

表1 qRT-PCR引物序列

圖1 梓醇對(duì)MC3T3-E1增殖的影響

Fig.1EffectofcatalpolonMC3T3-E1proliferation

①與空白對(duì)照組比較，P<0.01。

圖2 梓醇對(duì)MC3T3-E1 ALP分泌的影響

①Compared with blank control group，P<0.01.

Fig.2EffectofcatalpolonALPsecretioninMC3T3-E1

成骨細(xì)胞在骨形成過程中一般要經(jīng)歷早、中、晚三個(gè)階段，而ALP可以作為成骨細(xì)胞分化早期和中期的指示物[13]。本研究檢測分析了不同濃度梓醇作用于成骨細(xì)胞后ALP活性的變化。ALP活性測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梓醇在500 mg·mL-1濃度時(shí)，小鼠成骨細(xì)胞ALP活性有明顯的升高，提示成骨細(xì)胞的早期分化能力增強(qiáng)。茜素紅染色是茜素紅與鈣鹽沉積發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，成骨細(xì)胞進(jìn)一步礦化沉積的鈣結(jié)節(jié)同時(shí)被染成深紅色，鈣化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞分化成熟和礦化的標(biāo)志[14]。通過ARS可以了解成骨細(xì)胞晚期分化的情況。染色結(jié)果顯示500 mg·L-1梓醇促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)中鈣結(jié)節(jié)的形成，促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。成骨誘導(dǎo)液能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞合成膠原并鈣化。梓醇與成骨誘導(dǎo)液聯(lián)合使用，顯著增加了鈣結(jié)節(jié)的形成，提示梓醇可以協(xié)同成骨誘導(dǎo)液促進(jìn)骨基質(zhì)礦化。ALP和ARS檢測水平的升高提示，梓醇在體外有明顯的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化作用。

圖3 梓醇對(duì)MC3T3-E1礦化的影響(×50)

Fig.3EffectofcatalpolonMC3T3-E1mineralization(×50)

圖4 梓醇在成骨誘導(dǎo)液中對(duì)MC3T3-E1礦化的影響(×50)

Fig.4EffectofcatalpolonMC3T3-E1mineralizationinosteogenicinductionfluid(×50)

在成骨分化過程中，成骨細(xì)胞會(huì)分泌一些分化關(guān)鍵蛋白。Runx2是成骨細(xì)胞分化過程中的總開關(guān)，調(diào)節(jié)成骨分化中多個(gè)基因的表達(dá)；Col1α1為組成骨基質(zhì)的主要成分；Bglap是成骨分化晚期的標(biāo)志物，在骨基質(zhì)礦化成熟中起重要作用[15]。這些蛋白對(duì)應(yīng)的基因是成骨分化、礦化的重要標(biāo)志性基因。我們在mRNA水平檢測了給予梓醇后MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化關(guān)鍵基因的表達(dá)水平的變化。qRT-PCR結(jié)果提示，梓醇能顯著上調(diào)Runx2，Col1α1和Ocn的mRNA表達(dá)水平，在mRNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證梓醇具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化作用。

本研究通過體外模擬實(shí)驗(yàn)確定了梓醇具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化的作用；即使給予較高濃度，并未出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用，表現(xiàn)出較好的安全性。結(jié)合已有梓醇體內(nèi)血藥濃度檢測的報(bào)道[16]，為設(shè)計(jì)梓醇促進(jìn)成骨分化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

①與空白對(duì)照組比較，P<0.01；②與空白對(duì)照組比較，P<0.05。