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隨著人口老齡化以及不良生活方式的影響,糖尿病的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢。糖尿病是一種以胰島素分泌不足或抵抗為特征的代謝障礙性疾病,如何提高胰島素的分泌和減輕胰島素抵抗是治療糖尿病的關(guān)鍵。前期實驗證實,梓醇可以降低糖尿病大鼠空腹血糖水平,增加胰島素敏感性,保護胰島細胞[1]。本實驗將進一步探討梓醇對糖尿病大鼠胰島細胞Insulin表達的影響及作用機制。
1.1 實驗動物及材料 健康雄性Wistar大鼠共100只,8周齡,購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。高糖高脂飼料配方參照徐叔云《藥理實驗方法學(xué)》[2],購自哈爾濱市博士德試劑公司。
1.2 主要試劑及儀器 梓醇、鏈脲佐菌素、Insulin antibody、Anti-phospho-腺苷酸活化蛋白激酶-α1(AMPK-α1)、離心機、組織包埋機、分析天平、石蠟切片機、磁力攪拌器、奧林巴斯顯微攝像系統(tǒng)。
1.3 動物分組及干預(yù)方法 參照前期實驗[1]:選取雄性Wistar大鼠,8周齡,根據(jù)隨機數(shù)字表法分為正常組(10只)與實驗組(90只)。實驗組飼養(yǎng)8周高糖高脂飲食后經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素,劑量為15 mg/kg,以空腹血糖≥16.7 mmol/L作為2型糖尿病成模標準,將符合2型糖尿病成模標準的60只大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組。正常組和模型組灌胃蒸餾水5 mL/(kg·d);二甲雙胍組灌胃二甲雙胍90 mg/(kg·d);梓醇低、中、高劑量組分別灌胃梓醇2.5 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)。分別干預(yù)12周后,經(jīng)免疫組化檢測胰島細胞Insulin的表達水平,Western Blot 檢測AMPK-α1蛋白表達。
1.4 免疫組織化學(xué)法檢測胰島細胞Insulin的表達 用免疫組織化學(xué)法檢測胰島細胞中Insulin的表達。3%H2O2孵育,EDTA微波修復(fù)抗原,滴加一抗,37 ℃孵育1 h,4 ℃冰箱過夜,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗,滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗,選用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水透明,樹脂封片,顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照,光鏡下所見黃褐色顆粒為陽性,應(yīng)用HPIAS-1000型全自動圖像分析系統(tǒng),每組隨機選取5張切片,測定陽性染色積分光密度值(integral optical density,IOD),取其平均值作為該標本的IOD值。
1.5 Western Blot檢測AMPK-α1蛋白表達水平 分離胰島取5 mg組織,放入裂解液中裂解,在冰浴下勻漿,以4 ℃離心(10 000 r/min,10 min),取上清液用酚試劑法測定各組蛋白濃度后,制成蛋白濃度相等的樣品,取20 μL蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,之后電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h,分別滴加兔抗鼠AMPK-α1抗體,于4 ℃下孵育過夜,洗膜后選擇相應(yīng)堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h,應(yīng)用堿性磷酸酶顯色,并在凝膠自動成像分析系統(tǒng)下成像。以AMPK-α1蛋白表達作為觀測指標。
2.1 各組Insulin表達比較 干預(yù)12周后免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組、二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組大鼠胰島細胞Insulin均表達減少。與模型組比較,二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組大鼠胰島細胞Insulin表達增多,其中梓醇高劑量組、梓醇低劑量組Insulin表達與二甲雙胍組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。詳見圖1、圖2。
A為正常組;B為模型組;C為二甲雙胍組;D為梓醇高劑量組;E為梓醇中劑量組;F為梓醇低劑量組。與正常組比較,#P< 0.01;與模型組比較,*P< 0.01;與二甲雙胍組比較,△P< 0.01。
圖2各組Insulin表達灰度值比較
2.2 各組AMPK-α1蛋白表達比較 干預(yù)12周后Western Blot檢測結(jié)果顯示,與正常組比較,其他各組胰島細胞AMPK-α1蛋白表達均減少(P< 0.01);與模型組比較,二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組胰島細胞AMPK-α1蛋白表達增多(P< 0.01),其中梓醇高劑量組AMPK-α1蛋白表達較二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組表達增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。詳見圖3。
A為正常組;B為模型組;C為二甲雙胍組;D為梓醇低劑量組;E為梓醇中劑量組;F為梓醇高劑量組。與正常組比較,#P< 0.01;與模型組比較,*P< 0.01;與梓醇高劑量組比較,△P< 0.01。
圖3各組AMPK-α1蛋白表達的表達
糖尿病的主要病理基礎(chǔ)是胰島素分泌不足和(或)胰島素抵抗[3]。持續(xù)高血糖可導(dǎo)致心、腦、腎、眼底等多種靶器官損害[4-5]。前期實驗證實梓醇可以降低糖尿病大鼠血糖,增加胰島素分泌指數(shù),HE染色結(jié)果亦提示梓醇可保護胰島B細胞[1]。
本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察Insulin分泌水平,模型組大鼠胰島細胞呈淡黃色,而梓醇各劑量組胰島細胞胞漿呈橙黃色,經(jīng)灰度值統(tǒng)計結(jié)果證實,梓醇各劑量組胰島B細胞結(jié)構(gòu)相對完整,Insulin表達水平明顯高于模型組。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種能量調(diào)控器,由功能亞基(α)和調(diào)節(jié)亞基(β,γ)構(gòu)成的異源三聚體,AMPK 參與了體內(nèi)葡萄糖的代謝調(diào)節(jié),因此,AMPK 是糖尿病病人代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點之一[6]。激活A(yù)MPK 能夠促進葡萄糖的攝取、糖酵解、脂肪酸氧化并且抑制糖原合成、改善胰島素抵抗[7-8]。AMPK分多種亞型,其中起主要作用的是AMPK-α1。為探討梓醇增加胰島素分泌、減輕胰島素抵抗、降低血糖的機制,本研究應(yīng)用Western Blot方法檢測胰島素細胞AMPK-α1蛋白的表達水平,結(jié)果顯示,與其他各組比較,梓醇高劑量組AMPK-α1蛋白表達明顯增多,從而說明梓醇是通過調(diào)節(jié)AMPK-α1蛋白的表達以促進胰島細胞分泌胰島素,從而發(fā)揮降低血糖的作用。
參考文獻:
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