新霉素ELISA檢測方法的建立

劉沙洲，桑小雪，歐陽華學(xué)，雷紹榮，白林含,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065；2.成都市食品藥品檢測中心，四川 成都 610045；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066)

新霉素ELISA檢測方法的建立

劉沙洲1,2，桑小雪1，歐陽華學(xué)3，雷紹榮3，白林含1,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065；2.成都市食品藥品檢測中心，四川 成都 610045；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066)

目的：比較直接和間接競爭酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的優(yōu)缺點，建立新霉素殘留ELISA檢測方法。方法：利用自制的新霉素多克隆抗體，采用直接競爭和間接競爭ELISA方法檢測新霉素殘留，并比較兩種方法的優(yōu)缺點。結(jié)果：新霉素抗血清和慶大霉素的交叉反應(yīng)率為2.04%，和卡那霉素的交叉反應(yīng)率為0.02%，和氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。初步測試新霉素間接競爭ELISA法的準(zhǔn)確性和回收率。板內(nèi)誤差小于4%，板間誤差小于11%，回收率為135.5%～191.3%。直接競爭和間接競爭ELISA方法的檢測極限分別為28.58ng/mL和51.74ng/mL，達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。結(jié)論：建立了直接競爭和間接ELISA吸附檢測方法，條件優(yōu)化更成功的間接競爭ELISA可用于開發(fā)新霉素檢測試劑盒。

新霉素；多克隆抗體；競爭酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)；方法建立

從全球來看，在食用動物中限用、禁用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為一種發(fā)展趨勢。在1997年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(food and agriculture organization，F(xiàn)AO)就要求停止或禁止使用抗生素飼料添加劑，1998年12月又提議在1 0年內(nèi)淘汰抗生素飼料添加劑。2 0 0 4年，WHO、FAO和世界動物衛(wèi)生組織(office international des epizooties，OIE)聯(lián)合召開了一次專題討論會，討論了非人用抗生素的使用和抗生素的耐藥性問題。發(fā)達(dá)國家和有關(guān)國際組織都對抗生素在動物飼料中使用進(jìn)行了越來越嚴(yán)格的限制。特別是不準(zhǔn)將人用抗生素用于動物，在食用動物中禁用、限用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為世界共識[1-2]，是大勢所趨。

然而我國長期存在濫用、不合理使用抗生素飼料添加劑的情況，動物性食品中抗生素殘留的問題十分嚴(yán)重，不僅給消費者帶來健康上的損害，而且阻礙了我國動物產(chǎn)品的出口。近幾年，我國不斷加強對在食用動物中使用抗生素現(xiàn)象的監(jiān)督管理，以最大限度地減少對食品安全和人類健康的威脅。除了制訂、修訂法律法規(guī)、建立健全監(jiān)督檢驗體系、開展殘留監(jiān)控工作外，還不斷對殘留的限量作出規(guī)定。2002年，農(nóng)業(yè)部重新修訂發(fā)布獸藥在動物性食品中的最高殘留限量[3]，使規(guī)定限量的獸藥達(dá)到134種，主要是抗生素類藥物，其中就包括新霉素。

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)靈敏度高、特異性強、可用于大量樣品的快速篩選、儀器化程度低、檢測速度快、樣品前處理相對簡單、價格低和適于開發(fā)成攜帶方便的試劑盒等優(yōu)點，是國內(nèi)獸藥檢測現(xiàn)場監(jiān)控、大量樣本篩查的主要方法。用于抗生素殘留檢測的主要方法有直接競爭ELISA法和間接競爭ELISA法，本實驗擬比較直接和間接ELISA法的優(yōu)缺點，以建立新霉素殘留ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

KLH-NEO抗血清、包被抗原BSA-NEO 自制[4]；牛血清白蛋白、HRP-NEO、新霉素硫酸鹽、慶大霉素硫酸鹽、卡那霉素硫酸鹽、氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素鹽酸鹽 上海華舜生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG 博士德生物工程有限公司。

0.1mol/L檸檬酸、0.2mol/L十二水磷酸氫二鈉、鄰苯二胺、過氧化氫、2mol/L硫酸、pH7.4磷酸緩沖鹽水-0.05% Tween20(簡稱PBS-Tween 20)、pH9.6碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液(PBS)。

3550型酶標(biāo)測定儀 美國Bio-RAD公司；酶標(biāo)板成都博瑞克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 直接競爭ELISA反應(yīng)條件的建立

1.2.1.1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比

采用方陣測定法，包被不同質(zhì)量濃度的抗血清和陰性血清，直接測定HRP-NEO，以O(shè)D45nm接近于1.0為最佳反應(yīng)條件。

1.2.1.2 最佳反應(yīng)時間

設(shè)定抗血清和HRP-NEO的反應(yīng)時間為20、40、60、80、100、120min，選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間。

1.2.1.3 采用直接競爭ELISA法建立新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

用系列已知質(zhì)量濃度的新霉素和酶標(biāo)新霉素HRPNEO進(jìn)行直接競爭ELISA反應(yīng)，然后以B/B0(B0為0ng/mL孔的顯色值，B為其他質(zhì)量濃度孔的顯色值)為縱坐標(biāo)，新霉素質(zhì)量濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的B/B0值，可由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測樣品中新霉素的質(zhì)量濃度。

1.2.2 間接競爭ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.2.1 酶標(biāo)抗體工作用量的選擇

包被一抗直接測二抗，以O(shè)D450nm值接近于1.0時的酶標(biāo)二抗稀釋度為最適工作用量。

1.2.2.2 最佳包被抗原用量與最佳反應(yīng)血清用量

采用方陣測定法，加入BSA-NEO作為包被抗原，再加入KLH-NEO抗血清和陰性血清，按ELISA操作程序進(jìn)行，最后測定OD450nm值，以O(shè)D450nm值接近于1.0為最佳反應(yīng)條件。

1.2.2.3 最佳反應(yīng)時間

設(shè)定抗血清和BSA-NEO的反應(yīng)時間為20、40、60、80、100min，選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間。

1.2.2.4 采用間接競爭ELISA法建立新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

用系列已知質(zhì)量濃度的新霉素和抗血清進(jìn)行間接競爭ELISA反應(yīng)，然后以B/B0(B0為0ng/mL孔的顯色值，B為其他質(zhì)量濃度孔的顯色值)為縱坐標(biāo)，新霉素質(zhì)量濃度常用對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的B/B0值，可由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測樣品中新霉素的質(zhì)量濃度。

1.2.3 交叉反應(yīng)的測定[5]

采用間接競爭ELISA法測定慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素和KLH-NEO抗血清的結(jié)合反應(yīng)。新霉素的I50與這些抗生素的I50的百分比為交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率的高低決定了它們對新霉素檢測干擾程度的大小。

1.2.4 方法準(zhǔn)確性的測定

人工添加新霉素到PBS空白液中，使其在PBS中的終質(zhì)量濃度為60、250ng/mL。

以板內(nèi)誤差及板間誤差來表示該方法的精確度。板內(nèi)測定為同一酶標(biāo)板上同一樣本若干孔的平均值，板間測定為不同酶標(biāo)板上幾次測定結(jié)果的平均值，本實驗中板內(nèi)誤差和板間誤差均取3次測定的平均值為準(zhǔn)。

1.2.5 回收率的測定

回收率測定實驗主要檢驗檢測方法的可靠性。將新霉素質(zhì)量濃度為60、250ng/mL的PBS溶液各取0.1mL進(jìn)行間接競爭ELISA。同時以沒有加入新霉素的PBS作為正對照。測定時每個樣品質(zhì)量濃度設(shè)定3個重復(fù)，并重復(fù)3次實驗。然后進(jìn)行間接競爭ELISA測定OD450nm，計算抑制率，代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計算NEO的含量，并根據(jù)下式計算回收率：

2 結(jié)果與分析

2.1 直接競爭ELISA法

2.1.1 反應(yīng)條件的建立

2.1.1.1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比

表1 最佳包被抗血清用量與最佳HRP-NEO配比Table 1 Determination of optimal coating antiserum concentration and HRP/NEO ratio

由表1可知，在抗血清用量為1:1000、HRP-NEO配比為1:500時，OD450nm最大，初步確定最佳包被抗血清用量1:1000、最佳HRP-NEO配比1:500。作為對照的陰性血清幾乎沒有顯色。

2.1.1.2 最佳反應(yīng)時間

圖1 直接競爭ELISA法最佳反應(yīng)時間Fig.1 Determination of optimal reaction time of dc-ELISA

由圖1可知，反應(yīng)時間60min時，顯色效果最好，因此確定直接競爭ELISA法的顯色時間為60min。

2.1.2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(直接競爭ELISA法)Fig.2 Standard curve for neomycin determination by dc-ELISA

如圖2所示，B/B0達(dá)到90%時的新霉素質(zhì)量濃度為該實驗的最低檢測極限，根據(jù)回歸方程，計算出該直接競爭ELISA檢測方法的檢測限是28.58ng/mL，達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。

2.2 間接競爭ELISA法

2.2.1 反應(yīng)條件的確立

2.2.1.1 酶標(biāo)二抗工作用量

表2 酶標(biāo)二抗用量的確定Table 2 Determination of optimal enzyme labeled secondary antibody concentration

由表2可知，二抗稀釋倍數(shù)為2000的時候，OD450nm值最接近1.0。所以，確定二抗的最佳用量為1:2000。

2.2.1.2 最佳包被抗原質(zhì)量濃度與最佳反應(yīng)血清用量

由表3可知，抗血清1:2000稀釋、抗原1:400稀釋時，OD450nm值接近1.0，且相近數(shù)據(jù)差別不大。所以，確定KLH-NEO抗血清1:2000稀釋、BSA-NEO抗原1:400稀釋。作為對照的陰性血清幾乎沒有顯色。

表3 包被抗原用量和血清用量的確定Table 3 Determination of optimal coating antigen and serum concentrations

2.2.1.3 最佳反應(yīng)時間

圖3 間接競爭ELISA法最佳反應(yīng)時間Fig.3 Determination of optimal reaction time of idc-ELISA

由圖3可知，反應(yīng)時間為60min時，顯色效果最好。

2.2.2 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖4 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(間接競爭ELISA法)Fig.4 Standard curve for neomycin determination by idc-ELISA

如圖4所示，根據(jù)回歸方程，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線中I50為174.58μg/mL。間接競爭ELISA檢測方法的檢測極限是51.74ng/mL，達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)對新霉素規(guī)定的500 μg/kg MRL檢測限。

2.2.3 新霉素抗體和其他抗生素的交叉反應(yīng)率

表4 新霉素抗體和其他抗生素交叉反應(yīng)率實驗結(jié)果Table 4 Cross-reaction rates of prepared anti-neomycin antibodies with other antibiotics

新霉素的I50與其他抗生素的I50的百分比為交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率的高低決定了它們對新霉素檢測的干擾程度大小。本實驗選取了5種抗生素來進(jìn)行交叉反應(yīng)率的測定。其中，慶大霉素、卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素，和新霉素屬同一大類；由表4可知，新霉素抗體和慶大霉素及卡那霉素存在一定的交叉反應(yīng)，與青霉素、四環(huán)素、紅霉素幾乎沒有交叉反應(yīng)(＜0.01%)，這說明抗體的特異性好。新霉素抗體與慶大霉素、卡那霉素存在交叉反應(yīng)是因為慶大霉素、卡那霉素和新霉素同屬氨基糖苷類抗生素，存在結(jié)構(gòu)上的相似性[6]。而青霉素屬內(nèi)酰胺類抗生素；四環(huán)素屬四環(huán)素類抗生素；紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[7]。

2.2.4 方法準(zhǔn)確性的考察

表5 變異系數(shù)實驗結(jié)果Table 5 Coefficients of variation for inter-plate and intra-plate precision of idc-ELISA

如表5所示，NEO添加質(zhì)量濃度為60ng/mL時，3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為1.18%，板間變異系數(shù)為10.7%；NEO添加質(zhì)量濃度為250ng/mL時，3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為3.88%，板間變異系數(shù)為4.39%；說明該方法的穩(wěn)定性較好。

2.2.5 回收率

表6 回收率考察實驗結(jié)果Table 6 Results of spike recovery test of idc-ELISA

如表6所示，NEO添加質(zhì)量濃度為60ng/mL時的回收率不及添加質(zhì)量濃度為250ng/mL時的回收率理想，可能因為60ng/mL已接近于該方法的檢測限51.29ng/mL，導(dǎo)致誤差較大。

3 討 論

本實驗采用直接競爭和間接競爭ELISA初步建立了新霉素殘留的酶聯(lián)免疫測定方法。 兩種方法檢測極限都達(dá)到了國家對新霉素規(guī)定的500μg/kg MRL檢測限。在本實驗進(jìn)行的3次實驗中，間接競爭ELISA法的穩(wěn)定性明顯的強于直接競爭ELISA法，這可能與本實驗室制備的新霉素多克隆抗體質(zhì)量有關(guān)?？贵w是酶聯(lián)免疫測定中最關(guān)鍵的成分，提高檢測方法的穩(wěn)定性、靈敏性，關(guān)鍵在于提高抗體的質(zhì)量，要解決這個問題，首先可以從制備新霉素單克隆抗體入手[8-12]。相對于多克隆抗體，單克隆抗體具有更高的特異性、純度、均質(zhì)性和重復(fù)性。

建立一個成熟的酶聯(lián)免疫測定方法，需要進(jìn)行穩(wěn)定性實驗，用大量的實驗數(shù)據(jù)考察方法的交叉反應(yīng)率、板內(nèi)誤差、板間誤差和回收率。在此基礎(chǔ)上還需要增加檢測基質(zhì)的種類[13]，進(jìn)行樣品添加實驗，如在牛奶[14]、動物組織[15]中人工添加新霉素后再測定回收率?？傮w來說，要得到一個成熟穩(wěn)定的檢測體系，在抗體、基質(zhì)等方面還有許多的工作要做。

[1] 張彥明, 佘銳萍. 動物性食品衛(wèi)生學(xué)[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 73-86.

[2] 趙紅梅, 金升藻. 濫用抗生素對人畜的危害及對策研究[J]. 國外醫(yī)藥: 抗生素分冊, 2003, 24(4): 164-167.

[3] 農(nóng)業(yè)部第235號公告. 動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]. 2002.

[4] 劉沙洲, 黃非, 王麗麗, 等. 新霉素酶聯(lián)免疫檢測方法的研究: 新霉素抗體的制備[J]. 食品科技, 2007(3): 208-211.

[5] 石德時, 王桂枝, 畢丁仁, 等. 氯霉素抗體的制備[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2001, 20(5): 463-465.

[6] LOOMANS E E, Van WILTENBURG J, KOETS M, et al. Neomin as an immunogen for the development of a generic ELISA detecting gentamicin, kanamycin, and neomycin in milk[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2003, 51(3): 587-593.

[7] STOLKER A A, BRINKMAN U A. Analytical strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in food-producing animals: a review[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1067(1/2): 15-33.

[8] 葛紅霞. 單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2007(3):9-10.

[9] 譚雅麗, 石德時, 王桂枝, 等. 抗氯霉素單克隆抗體的制備及鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2000(增刊1): 63-65.

[10] 魏書林, 曹振, 沈建忠, 等. 抗氯霉素單克隆抗體的制備和鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志, 2004, 40(8): 62-64.

[11] 王選年, 楊艷艷, 李青梅, 等. 鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及其特性[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002(6): 30-33.

[12] 蔡勤仁, 曾振靈, 楊桂香. 恩諾沙星單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(7): 1060-1064.

[13] 許艇, 秦治翔, 王文珺, 等. 甲萘威ELISA方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2004, 10(5): 569-572.

[14] 李利東, 宓曉黎, 袁建興, 等. 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒應(yīng)用于牛奶中四環(huán)素殘留的測定[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù), 2004(2): 52-54.

[15] 關(guān)嶸. 應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測動物源性食品中氯霉素殘留的研究[J].檢驗檢疫科學(xué), 2002, 12(4): 5-10.

Development of Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Neomycin

LIU Sha-zhou1,2，SANG Xiao-xue1，OUYANG Hua-xue3，LEI Shao-rong3，BAI Lin-han1,*
(1. School of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China；2. Food and Drug Testing Center, Chengdu 610045,China；3. Analysis and Testing Center, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

In this study, we describe the advantages and disadvantages of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-ELISA) and indirect competitive ELISA (idc-ELISA) and ELISA methods for the detection of neomycin. Antineomycin polyclonal antibodies were prepared and used to detect neomycin by dc-ELISA and idc-ELISA. The cross-reaction rates of prepared anti-neomycin polyclonal antibodies with gentamincin and kanamycin were 2.04% and 0.02%, respectively,and with ampicillin, erythromycin and tetracycline all less than 0.01%. The accuracy and recovery of idc-ELISA were tested with an intra-plate error of less than 4%, an inter-plate error of less than 11% and a recovery between 135.5% and 191.3%. The detection limits of dc-ELISA and idc-ELISA were 28.58 ng/mL and 51.74 ng/mL, respectively, both of which were below the national maximum residue limit (MRL) of 500μg/kg. Therefore, a dc-ELISA method and an idc-ELISA method to detect neomycin have successfully established. Further, the idc-ELISA method where the working conditions were better optimized can be used for the development of neomycin test kit.

neomycin；polyclonal antibodies；competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)；method establishment

S854

A

1002-6630(2011)14-0227-05

2010-04-26

四川省公益性研究計劃項目(2008NG004)

劉沙洲(1983—)，女，碩士，主要從事微生物學(xué)與生物檢測研究。E-mail：liushazhou566@sina.com

*通信作者：白林含(1970—)，女，教授，博士，主要從事微生物分子生物學(xué)研究。E-mail：bailinhan@scu.edu.cn