劉莊蔚 朱健萍 梁秋霞 蔣潔 楊欣智

(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧 530021)

硫酸新霉素(neomycin sulfate)是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的氨基糖苷類抗生素，它是1949年Waksman等[1]從新霉素鏈霉菌代謝產(chǎn)物中分離得到的混合物。其抗菌譜較廣，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、結(jié)核桿菌等均有抑制作用[2]，由于新霉素有顯著的腎毒性和耳毒性，故常被制備成乳膏劑、軟膏劑和滴眼液等外用制劑供患者使用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，硫酸新霉素的主要成分為新霉素A、B、C 3種，新霉素A(新霉胺)僅微量，是新霉素B、C的降解產(chǎn)物之一[1]。中國(guó)藥典2015年版二部采用薄層色譜法控制了硫酸新霉素中新霉胺的含量，方法專屬性較差且分離能力較低，無(wú)法對(duì)其各組分及有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行深入分析。目前文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定硫酸新霉素或降解雜質(zhì)新霉胺，多采用高效液相-柱前衍生化法[3-4]、高效液相-蒸發(fā)光散射法[5-6]、高效液相-脈沖安培檢測(cè)法[2]。但柱前衍生化法操作繁瑣，影響結(jié)果的因素較多；蒸發(fā)光散射法靈敏度較低，不利于微量雜質(zhì)的檢出；脈沖安培檢測(cè)法，穩(wěn)定性較差，色譜條件嚴(yán)格。電噴霧檢測(cè)器是一種新型的高效液相色譜通用性檢測(cè)器[1]，靈敏度較高，通用。其原理是基于霧化-氣溶膠的HPLC 檢測(cè)器，通過(guò)Corona電暈針使氮?dú)鈳щ?，而后將帶電氮?dú)馀c經(jīng)干燥過(guò)的洗脫液中的溶質(zhì)顆粒逆向充分混合，帶電氮?dú)獾碾姾赊D(zhuǎn)移，使溶質(zhì)顆粒帶電后，進(jìn)入靜電計(jì)檢測(cè)電信號(hào)值。該檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)不依賴于化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，與溶質(zhì)質(zhì)量成正比關(guān)系[7]。目前尚未見采用高效液相色譜-電噴霧檢測(cè)器法測(cè)定硫酸新霉素各組分及有關(guān)物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道。

本文建立了測(cè)定硫酸新霉素中新霉素B、C、新霉胺和有關(guān)物質(zhì)的高效液相-電噴霧檢測(cè)法，專屬性強(qiáng)，靈敏度較高。與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載的薄層色譜法比較，測(cè)定的雜質(zhì)更多，可為硫酸新霉素的質(zhì)量控制提供新的技術(shù)手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate-3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾公司)；電噴霧檢測(cè)器(賽默飛世爾公司)；XA205DU電子天平(Mettler-toledo)。

1.2 對(duì)照品

硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：1 2 8 4 5 8，D r.Ehrenstorfer GmbH公司，新霉素B含量：80.0%，主要雜質(zhì)新霉素C相對(duì)含量：9.6%，水分：0.5%)，新霉胺對(duì)照品(批號(hào)：130411-200908，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供)，新霉素B六乙酸酯(批號(hào)：18-MAR-159-1，Toronto research chemicals公司提供)，新霉素C六乙酸酯(批號(hào)：19-MAR-20-1、Toronto research chemicals公司提供)。

1.3 試劑

三氟乙酸(Fisher Scientific，批號(hào)：066963，試劑純)，水為超純水。

1.4 樣品

17批硫酸新霉素原料，分別來(lái)自企業(yè)A和B。

2 試驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 HPLC-CAD條件

色譜柱：Waters Xselect HSS T3(4.6mm×250mm,5μm)，流動(dòng)相：0.15mol/L的三氟乙酸溶液，流速：1mL/min，進(jìn)樣量：10μL，柱溫：30℃，CAD檢測(cè)器霧化溫度：45℃。

2.2 溶液的制備

供試品溶液：取本品適量，加水溶解并稀釋成濃度為1mg/mL的溶液，搖勻，作為供試品溶液。

自身對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液1mL，置于20mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，即得濃度為0.05mg/mL自身對(duì)照溶液。

新霉胺對(duì)照品溶液：精密稱取新霉胺對(duì)照品10mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為新霉胺對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取2mL，置于10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，即得2μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密稱取硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，再精密量取“2.2”項(xiàng)下的新霉胺對(duì)照品儲(chǔ)備液2mL，置于10mg容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。稱取新霉素B六乙酸酯對(duì)照品及新霉素C六乙酸酯對(duì)照品約1mg，分別置于10mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得新霉素B與C定位用溶液。分別精密量取10μL，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下條件分析，結(jié)果見圖1～3。色譜圖中，新霉素B和C的分離度為2.8，新霉素A與其周圍的雜質(zhì)峰也能達(dá)到基線分離，分離度為1.5，見圖1，滿足分析要求。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取溶劑水照“2.1”項(xiàng)下條件分析，結(jié)果顯示空白溶劑不干擾樣品測(cè)定，方法專屬性好。

2.5 破壞性試驗(yàn)

取硫酸新霉素原料進(jìn)行破壞，考察其降解情況。精密稱取硫酸新霉素原料504.24mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1mL，置于10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為未破壞的供試品溶液。

圖1 系統(tǒng)適用性圖譜Fig.1 Chromatograms in system suitability test

圖2 新霉素B色譜圖Fig.2 Chromatograms of neomycin B

圖3 新霉素C色譜圖Fig.3 Chromatograms of neomycin C

(1)酸破壞：精密量取上述儲(chǔ)備液1mL，置于10mL容量瓶中，加6mol/L的鹽酸溶液1mL，放置16h后，用2mol/L的氫氧化鈉中和，并用水稀釋至刻度，搖勻。

(2)堿破壞：精密量取上述儲(chǔ)備液1mL，置于10mL容量瓶中，加2mol/L的氫氧化鈉溶液1mL，放置16h后，用6mol/L的鹽酸中和，并用水稀釋至刻度，搖勻。

(3)氧化破壞：精密量取上述儲(chǔ)備液1mL，置于10mL容量瓶中，加雙氧水1mL，放置16h后，用水稀釋至刻度，搖勻。

(4)高溫破壞：精密量取上述儲(chǔ)備液1mL，置于10mL容量瓶中，置于沸水浴中加熱3h后，取出，冷卻，并用水稀釋至刻度，搖勻。

(5)光照破壞：精密量取上述儲(chǔ)備液1mL，置于10mL容量瓶中，置于強(qiáng)光4000Lx 48h后，取出，用水稀釋至刻度，搖勻。

取上述溶液照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，圖4為硫酸新霉素原料未破壞及破壞試驗(yàn)后的色譜圖。

試驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸新霉素在酸破壞的條件下，雜質(zhì)新霉胺的含量增加。在氧化破壞的條件下，產(chǎn)生了新的降解雜質(zhì)，新霉素B、C和新霉胺分別與相鄰雜質(zhì)的分離度為2.1和2.6、1.4和1.6、3.9和0.9。除新霉胺與其后面的雜質(zhì)分離度較小外，新霉素B與C均能與破壞試驗(yàn)產(chǎn)生的雜質(zhì)峰分離良好，系統(tǒng)基本可行。其他破壞條件下均無(wú)新的降解雜質(zhì)產(chǎn)生，說(shuō)明硫酸新霉素在堿性、高溫、光照的條件下穩(wěn)定。

2.6 檢出限與定量限

取硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品和新霉胺對(duì)照品適量，分別加水溶解并逐級(jí)稀釋成系列稀釋溶液，按信噪比為3:1測(cè)定檢測(cè)限，新霉素B檢測(cè)限為0.02μg，新霉胺檢測(cè)限為0.003μg。按信噪比為10:1測(cè)定定量限，新霉素B檢測(cè)限為0.07μg，新霉胺檢測(cè)限為0.012μg。

2.7 線性關(guān)系考察

2.7.1 硫酸新霉素B和C線性關(guān)系考察

精密取稱硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品11.09mg，置于10mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為硫酸新霉素對(duì)照品貯備液(新霉素B濃度：0.8828mg/mL，新霉素C濃度：0.1059mg/mL)。再精密量取0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、1.6和2.0mL，分別置于10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液1～7。照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明新霉素B、C在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表1)，滿足方法學(xué)要求。

圖4 供試品溶液原液及5種方式破壞溶液的色譜圖Fig.4 Chromatograms of original samples solution and sample solution destroyed by fi ve ways

2.7.2 新霉胺線性關(guān)系考察精密稱取新霉胺對(duì)照品10.36mg，置于100mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為新霉胺對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度為：0.1036mg/mL)。再精密量取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分別置于10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液1～8。按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明新霉胺在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表1)，滿足方法學(xué)要求。

2.8 溶液穩(wěn)定性考察

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of linear relationships

取供試品溶液分別在放置0、2、4、8、12和16h后進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定新霉素B、C、新霉胺的峰面積和其他雜質(zhì)的總峰面積，結(jié)果表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定，新霉素B峰面積的RSD為0.8%、新霉素C峰面積的RSD為1.4%、新霉胺峰面積的RSD為1.6%、其他雜質(zhì)總峰面積的RSD為4.1%。

2.9 進(jìn)樣精密度

分別取“2.7.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液4和“2.7.2”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液6連續(xù)進(jìn)樣6次，分別以新霉素B和新霉胺的峰面積考察儀器精密度，結(jié)果新霉素B峰面積的RSD為1.4%，新霉胺峰面積的RSD為1.1%，表明儀器精密度良好。

2.10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取一批硫酸新霉素原料分別制備6份供試品溶液，計(jì)算新霉胺的含量，結(jié)果6份樣品中新霉胺含量的RSD為2.8%，符合方法學(xué)的要求。

2.11 新霉胺回收率試驗(yàn)

取一批硫酸新霉素原料做加樣回收實(shí)驗(yàn)，稱取9份，每份約10mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，標(biāo)記為回收率1～9，回收率1～3精密加入“2.2”項(xiàng)下的新霉胺對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1mL，回收率4～6精密加入“2.2”項(xiàng)下的新霉胺對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2mL，回收率6～9精密加入“2.2”項(xiàng)下的新霉胺對(duì)照品儲(chǔ)備溶液3mL，用水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。按上述方法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，平均回收率為93.1%(表2)，符合方法學(xué)要求。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

2.12 樣品的測(cè)定

分別取17批原料，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液、自身對(duì)照溶液及新霉胺對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。雜質(zhì)新霉胺的含量按外標(biāo)法計(jì)算，新霉素C組分及其他雜質(zhì)按自身對(duì)照法計(jì)算，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

硫酸新霉素是強(qiáng)極性化合物，極易溶于水，在反相色譜柱中幾乎無(wú)保留，需采用離子對(duì)試劑提高新霉素在色譜柱中的保留行為。電噴霧檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相有特殊的要求，需采用揮發(fā)性的試劑。參考相關(guān)文獻(xiàn)，嘗試采用三氟乙酸水溶液-甲醇系統(tǒng)為流動(dòng)相。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機(jī)相甲醇的比例為5%時(shí)，新霉素B和新霉素C無(wú)法分離，隨著甲醇比例的減少，新霉素B和新霉素C的分離度開始增加。當(dāng)用純水相時(shí)，新霉素B和新霉素C的分離度能達(dá)到3.0左右，同時(shí)新霉胺也能與相鄰雜質(zhì)達(dá)到基線分離。因此，采用三氟乙酸水溶液100%作為流動(dòng)相。此外，我們還對(duì)三氟乙酸的濃度進(jìn)行了篩選，考察了0.1、0.15和0.2mol/L的三氟乙酸溶液，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這3種濃度的三氟乙酸均能使新霉素B和C達(dá)到基線分離，隨著三氟乙酸濃度的增加，新霉素B和C的分離度也相應(yīng)的增加。但當(dāng)濃度為0.1mol/L時(shí)，新霉胺與相鄰雜質(zhì)無(wú)法達(dá)到基線分離，當(dāng)濃度為0.15mol/L時(shí)，新霉胺與相鄰雜質(zhì)基本達(dá)到分離，分離度為1.5，當(dāng)濃度為0.2mol/L時(shí)，新霉胺與相鄰雜質(zhì)的分離度為1.8。考察了0.15和0.2mol/L的三氟乙酸水溶液的pH值，分別為1.12和0.9，0.2mol/L的三氟乙酸水溶液對(duì)柱子的損傷相對(duì)較大。綜合比較，采用0.15mol/L的三氟乙酸水溶液做為流動(dòng)相。同時(shí)由于采用了酸性較強(qiáng)的純水相作為流動(dòng)相，本研究選擇了親水且耐酸的色譜柱Waters Xselect HSS T3(4.6mm×250mm, 5μm)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of the determination

3.2 定量方式的選擇

電噴霧檢測(cè)器是繼蒸發(fā)光散射檢測(cè)器后的一款通用性質(zhì)量檢測(cè)器，它的響應(yīng)值與化合物的結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，對(duì)質(zhì)量相近的化合物響應(yīng)值基本相同，在低濃度范圍內(nèi)響應(yīng)值與濃度呈線性關(guān)系，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法或外標(biāo)法直接定量，無(wú)需采用雙對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-9]。新建立的方法中新霉素B、C和新霉胺在一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)具良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.998以上。新霉素B和新霉素C在歐洲藥典中有確定結(jié)構(gòu)式，兩者為立體異構(gòu)體[10]；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示新霉素C的響應(yīng)因子為0.93，與新霉素B基本一致。新霉胺和新霉素B的分子量相差較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示新霉胺的響應(yīng)因子為1.6。因此，新霉素C的含量可根據(jù)對(duì)新霉素B對(duì)照品或標(biāo)注有新霉素B含量的硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)行折算；新霉胺的含量計(jì)算需用新霉胺對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算或硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品校正因子法折算。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析

利用建立的方法測(cè)定了17批硫酸新霉素原料中的新霉素B、新霉素C、新霉胺及其他有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果顯示，主組分新霉素B的含量在69.35%～84.58%之間；新霉素C的含量在10.21%～23.18%之間；新霉胺的含量在0.118%～0.363%之間；其他最大單雜的含量在1.25%～3.70%之間；其他雜質(zhì)總量在5.07%～9.76%之間。由于國(guó)內(nèi)藥典未對(duì)硫酸新霉素的組分進(jìn)行控制，17批硫酸新霉素原料主成分含量變化范圍過(guò)寬。歐洲藥典采用高效液相-脈沖安培電化學(xué)檢測(cè)法對(duì)硫酸新霉素中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了控制，其中新霉胺不得過(guò)2.0%，新霉素C為3.0%～15.0%，其他最大雜質(zhì)不得過(guò)5.0%，其他總雜質(zhì)不得過(guò)15.0%。參考?xì)W洲藥典的要求，有7批原料中新霉素C含量超過(guò)了限度。對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大部分樣品當(dāng)新霉素C含量較高時(shí)，主組分新霉素B的含量相應(yīng)降低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，新霉素是由發(fā)酵產(chǎn)生的多組分抗生素，新霉素B和新霉素C的比例與發(fā)酵工藝有關(guān)，主要產(chǎn)物新霉素B相對(duì)其他組分而言活性強(qiáng)、毒性低，是發(fā)酵過(guò)程中需要監(jiān)測(cè)的主要組分[2]。但由于試驗(yàn)條件有限，沒(méi)有分離到新霉素B和新霉素C的純品進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定，具體硫酸新霉素的組分及雜質(zhì)和效價(jià)的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。

4 小結(jié)

本文建立了測(cè)定硫酸新霉素組分B、C及有關(guān)物質(zhì)的HPLC-CAD方法。該方法較現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法(薄層色譜法)和ELSD法提高了靈敏度和分離度，能更好地測(cè)定硫酸新霉素的有關(guān)物質(zhì)及組分。因此，新建立的HPLC-CAD方法可以更好地控制硫酸新霉素的質(zhì)量，也為今后研究新霉素組分與效價(jià)之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。