響應面法優(yōu)化金針菇抗氧化物質(zhì)的超聲波輔助提取工藝

楊 念，芮漢明*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

響應面法優(yōu)化金針菇抗氧化物質(zhì)的超聲波輔助提取工藝

楊 念，芮漢明*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

目的：采用超聲波輔助提取法從金針菇中提取抗氧化物質(zhì)，利用響應曲面法對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝參數(shù)。方法：采用DPPH自由基法檢測提取物的清除自由基能力，選擇對清除率有顯著影響的3個因素——乙醇體積分數(shù)、超聲功率、提取時間，做三因素三水平響應面分析試驗。結(jié)果：通過典型性分析得出最優(yōu)工藝為乙醇體積分數(shù)95%、超聲頻率40kHz、超聲功率300W、提取時間20.24min。在此條件下所得提取物DPPH自由基清除率達到了85.32%。結(jié)論：超聲波輔助提取的金針菇抗氧化物質(zhì)具有較高清除率，響應曲面法優(yōu)化提取金針菇抗氧化物質(zhì)條件參數(shù)可行。

金針菇；抗氧化；超聲波；響應面分析

人們長期以來一直使用合成抗氧化劑進行食品及油脂的抗氧化和保鮮，但實驗證明人工合成抗氧化劑有較多的副作用，如2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)的毒性很大，它能抑制人體呼吸酶活性、使肝臟微粒體酶活性增加，能使人的WI-38胚胎細胞分裂后期發(fā)生陽性的染色體異常[1]。國內(nèi)使用的其他化學合成抗氧化劑如叔丁基對苯二酚等，目前實驗證實或懷疑有潛在的致癌作用[2]，過量添加會損害人體健康。因此許多人工合成抗氧化劑在國外已被限制使用。近幾年，國際上傾向于研究和開發(fā)安全無毒和天然的食品抗氧化劑，研究和應用天然抗氧化劑也成為當今世界食品工業(yè)的重要課題。

金針菇(Flammulina velutipes)別名毛柄金錢菇、冬菇、樸菇和構(gòu)菌等[3]，它屬于口蘑科和小火焰菌屬[4]，因其金黃細嫩的柄如金針而得名。目前，對于金針菇提取物的抗氧化性研究比較少，在國外略間報道[5-7]。

超聲波提取技術(shù)是利用超聲具有的機械效應、空化效應及熱效應[8]，加強了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，加速了有效成分的浸出，超聲波提取的機理[9]正是體現(xiàn)于這些特殊效應，而且超聲波提取法具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點[10]，目前己成功地用于多種植物有效成分的提取[11-12]。響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝參數(shù)，解決多變量問題的統(tǒng)計方法，系數(shù)學與統(tǒng)計學的結(jié)合，有助于快速建模、縮短優(yōu)化時間和提高工程應用可信度[13]。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，它成為一種精確度高、優(yōu)化效果好、具有很高實用價值的優(yōu)化技術(shù)[14]。本實驗運用響應面法(RSM)對超聲波提取金針菇抗氧化物質(zhì)的工藝條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇子實體 市售。DPPH自由基 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；722S型分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TH300型超聲波清洗機 濟寧天華超聲電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

金針菇子實體，60℃烘干，粉碎過50目篩。將金針菇粉與不同體積分數(shù)的乙醇混合加入到具塞錐形瓶中，進行超聲處理，然后將提取物離心(4000r/min，15min)過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/5，用DPPH自由基法測其抗氧化、清除自由基的能力。

1.3.2 DPPH自由基法檢測抗氧化性

在1mL 200μmol/L DPPH自由基無水乙醇溶液中加入500μL樣品溶液，用無水乙醇定容至2mL，用力搖勻后于室溫放置30min，測定其在波長5l7nm處的吸光度(As)；以500μL無水乙醇代替樣品為空白對照(A0)；以500μL樣品與1mL無水乙醇混合液為樣品對照(Ax)，以消除樣品本身顏色的影響；以無水乙醇調(diào)儀器零點。計算抗氧化劑對DPPH自由基的清除率(R)[15-16]。

1.3.3 金針菇抗氧化物質(zhì)提取的單因素試驗

對超聲頻率、超聲功率、超聲時間、乙醇體積分數(shù)進行單因素試驗，分別考察這4個因素對自由基清除率的影響。

超聲頻率的選擇：取3g經(jīng)過前處理備用的金針菇粉，在料液比1:10(g/mL)、超聲功率180W、超聲時間40min、乙醇體積分數(shù)75%條件下，分別在超聲頻率20、25、40、(20 ＋25)、(20 ＋40)、(25 ＋40)kHz時進行超聲波提取試驗，測定試驗所得的金針菇提取液的自由基清除率，通過提取液自由基清除率的大小確定超聲頻率的范圍。

超聲功率的選擇：其他條件不變，超聲頻率40kHz，分別在超聲功率60、120、180、240、300W時進行超聲波提取試驗，測定試驗所得的金針菇提取液的自由基清除率，通過提取液自由基清除率的大小確定超聲功率的范圍。

超聲時間的選擇：其他條件不變，分別在超聲時間10、20、30、40、50、60min時進行超聲波提取試驗，測定試驗所得的金針菇提取液的自由基清除率，通過提取液DPPH自由基清除率的大小確定超聲時間的范圍。

乙醇體積分數(shù)的選擇：其他條件不變，分別在乙醇體積分數(shù)55%、65%、75%、85%、95%時進行超聲波提取試驗，測定試驗所得的金針菇提取液的DPPH自由基清除率，通過提取液DPPH自由基清除率的大小確定乙醇體積分數(shù)的范圍。

1.3.4 響應面法優(yōu)化金針菇抗氧化物質(zhì)提取工藝條件

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定超聲頻率40kHz，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，分別以乙醇體積分數(shù)、超聲功率和超聲時間為考察對象，以金針菇提取液的自由基清除率為響應值，設(shè)計三因素三水平響應面分析，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 金針菇抗氧化物質(zhì)提取響應面試驗因素水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇抗氧化物質(zhì)提取單因素試驗

2.1.1 超聲頻率對金針菇提取物FPPH自由基清除率的影響

圖1 超聲頻率對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on DPPH radical scavenging ratio of Flammulina velutipes extract

如圖1所示，隨著超聲波頻率的增加，DPPH自由基清除率出現(xiàn)緩慢的增加，但從經(jīng)濟效益及產(chǎn)率兩方面來考慮，應選擇40kHz為宜。因此以后的提取試驗都選用40kHz，在響應面試驗中不做考察。

2.1.2 超聲功率對金針菇提取物DPPH自由基清除率的影響

圖2 超聲功率對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on DPPH radical scavenging ratio of Flammulina velutipes extract

如圖2所示，隨著超聲波功率的增加，DPPH自由基清除率呈顯著的增加，在超聲功率小于180W時，清除率的上升趨勢比較平緩，而當功率大于180W時，清除率增長迅速，趨勢較陡，所以試驗選擇超聲功率為180～300W為宜。

2.1.3 超聲時間對金針菇提取物DPPH自由基清除率的影響

圖3 超聲時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on DPPH radical scavenging ratio of Flammulina velutipes extract

如圖3所示，在10～20min時，隨著超聲時間的增加，提取液DPPH自由基清除率呈上升趨勢，但當超聲波處理時間進一步延長時，DPPH自由基清除率呈不斷下降趨勢，因此超聲時間以20min為宜。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對金針菇提取物DPPH自由基清除率的影響

如圖4所示，DPPH自由基清除率隨著乙醇體積分數(shù)的增加，呈不斷上升的趨勢，當乙醇體積分數(shù)75%～85%時，DPPH自由基清除率稍有下降，而當乙醇體積分數(shù)達到85%以上時，清除率又呈現(xiàn)不斷上升趨勢，因此選擇乙醇體積分數(shù)75%～95%為宜。

圖4 乙醇體積分數(shù)對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on DPPH radical scavenging ratio of Flammulina velutipes extract

2.2 金針菇抗氧化物質(zhì)提取工藝響應面法優(yōu)化試驗

表2 金針菇抗氧化物質(zhì)提取工藝響應面試驗方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表3 回歸方程各項方差分析Table 3 Analysis of variance of each term of the constructed regression equation

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應面設(shè)計試驗，運用根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，對乙醇體積分數(shù)(A)、超聲功率(B)及超聲時間(C)作如下變換：X1=(A－85)/15，X2=(B－240)/60，X3=(C－20)/10。以X1、X2、X3為自變量，以DPPH自由基清除率為響應值(Y)，試驗方案及結(jié)果見表2。

17個試驗分為析因點和零點，試驗號1～12是析因試驗，13～17是中心試驗。以金針菇提取液的自由基清除率為響應值，利用Design Expert 7.0.0對表2中試驗數(shù)據(jù)(響應值)進行多元回歸擬合及對模型進行方差分析，分析結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，該模型回歸顯著。由方差分析結(jié)果可知，乙醇體積分數(shù)、超聲功率和超聲時間3個因素在試驗過程中均起主要作用，對清除率的影響順序為：乙醇體積分數(shù)＞超聲功率＞超聲時間。

各因素經(jīng)二次多項回歸擬合后，得到DPPH自由基清除率對乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲時間3個因素的二次多項回歸方程：

經(jīng)方差分析得到：X1、X2項極顯著，X3、X12、X32項對模型的影響也達到了顯著水平。因此各種因素和提取率的關(guān)系為二次曲線關(guān)系，但各種因素的交互作用的影響都不顯著，說明各因素之間的交互作用很小。

通過回歸方程來繪制分析圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，做出響應面立體分析圖和相應等高線圖，由圖5可知，乙醇體積分數(shù)是影響DPPH自由基清除率的最主要因素，超聲功率次之，選擇合適的乙醇體積分數(shù)和超聲功率，可獲得較高的清除率。當超聲時間20min時，研究乙醇體積分數(shù)和溫度的關(guān)系，由圖5A可以看出，當乙醇體積分數(shù)不變時，清除率隨超聲功率的升高而升高，但當乙醇體積分數(shù)處于較低水平時，清除率曲面趨于平緩，而乙醇體積分數(shù)處于較高水平時，清除率曲面較陡；當超聲功率不變時，清除率隨乙醇體積分數(shù)的升高而升高，但其清除率的增長趨勢明顯高于超聲頻率的。當超聲功率240W時，研究乙醇體積分數(shù)和超聲時間對清除率的影響，由圖5B得出，當超聲時間不變時，清除率隨乙醇體積分數(shù)的增大而升高；當乙醇體積分數(shù)不變時，清除率隨溫度的升高而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且其趨勢的變化程度也明顯低于乙醇體積分數(shù)的。當乙醇體積分數(shù)85%時，研究超聲功率和超聲時間對清除率的影響，由圖5C得出，當超聲功率不變時，清除率隨超聲時間的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當超聲時間不變時，清除率隨超聲功率的升高而升高，超聲功率對清除率的影響程度比超聲時間的更顯著。

圖5 兩因素及其交互作用響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of pariwise interactions of four operating parameters on DPPH radical scavenging ratio of Flammulina velutipes extract

根據(jù)回歸方程和實際情況得出最優(yōu)的工藝條件為乙醇體積分數(shù)95%、超聲頻率40kHz、超聲功率300W、提取時間20.24min。在此條件下提取理論值達到84.94%，驗證實驗條件下實際最大值85.32%，理論值與實際值的誤差不超過0.45%，結(jié)果表明，該模型可以較好地反映出金針菇抗氧化物質(zhì)提取的條件，從而也證明了響應曲面法優(yōu)化提取金針菇抗氧化物質(zhì)條件參數(shù)的可行性。

2.3 超聲波輔助提取法與其他方法提取金針菇抗氧化物質(zhì)的比較

通過進行乙醇浸提(料液比1:10、提取時間24h、乙醇體積分數(shù)95%)以及乙醇回流提取(料液比1:10、提取時間90min、提取溫度40℃、乙醇體積分數(shù)95%)，金針菇提取液的DPPH自由基清除率分別為83.09%和82.18%。用超聲波輔助法提取金針菇抗氧化物質(zhì)的最優(yōu)工藝進行提取，并與乙醇浸提以及乙醇回流提取進行比較可知，超聲波法提取金針菇抗氧化物質(zhì)的最優(yōu)工藝穩(wěn)定可靠，同時超聲波法輔助提取法優(yōu)于其他兩種方法，不僅縮短了提取時間，降低了能耗，而且提取率也有一定的提高。

3 結(jié) 論

超聲波的工作原理是利用其產(chǎn)生的空化、機械擾動等物理作用粉碎植物細胞壁使目標物大量的浸出，利用超聲波輔助提取金針菇抗氧化物質(zhì)的效果比較明顯，提取效率高、提取時間短、提取溫度低等優(yōu)點，保證了金針菇在提取過程中不會因為長時間的高溫而降低其抗氧化活性。

通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取金針菇抗氧化物試驗，得到二次多項式回歸模型(R2=0.9250)。最終確定了超聲波輔助提取金針菇抗氧化物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)95%、超聲頻率40kHz、超聲功率300W、提取時間20.24min。在此工藝條件下，金針菇提取液的DPPH自由基清除率達到85.32%。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Antioxidants from the Fruiting Body of Flammulina velutipes by Response Surface Analysis

YANG Nian，RUI Han-ming*
(College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Objective: Ultrasonic treatment was introduced to the ethanolic extraction of antioxidants from the fruiting body of Flammulina velutipes with the aim of enhancing cell disruption, and the extraction process was optimized by response surface methodology. Methods: For the evaluation of the ability of extract to scavenge free radicals, a DPPH free radical system was constructed. Ethanol concentration, ultrasonic power and extraction time were selected as major factors that influence DPPH radical scavenging ratio, and the pairwise interactive influences of the three factors at three levels on DPPH radical scavenging ratio were probed by response surface analysis. According to the results of canonical analysis, the optimum conditions for the extraction of antioxidants with high DPPH radical scavenging activity were using 95% ethanol for 20.24 min extraction under the assistance of ultrasonic treatment at 40 kHz and 400 W. The extract under these conditions presented a DPPH radical scavenging ratio of 85.32%. Conclusion: Ultrasonic treatment is helpful to extract highly DPPH radical scavenging antioxidants. Response surface methodology has good feasibility to be used as a mathematical approach to optimize process parameters for the extraction of antioxidants from the fruiting body of Flammulina velutipes.

Flammulina velutipes；antioxidant；ultrasonic；response surface analysis

TS201.1

A

1002-6630(2011)04-0126-05

2010-04-02

楊念(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與貯藏。E-mail：yn1311@sina.com

*通信作者：芮漢明(1953—)，男，副教授，學士，研究方向為食品加工與貯藏。E-mail：rhmlsy@tom.com