李愛軍，王明泰，吳連鵬，牟 峻，盧利軍，周 曉，胡婷婷，趙冬晗，姚天玲

(1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春 130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；3.長春大成玉米開發(fā)有限公司，吉林 長春 130062)

高通量全自動(dòng)儀器法測(cè)定植物源性食品中甲基托布津殘留量

李愛軍1，王明泰1，吳連鵬1，牟 峻1，盧利軍1，周 曉1，胡婷婷1，趙冬晗2，姚天玲3

(1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春 130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；3.長春大成玉米開發(fā)有限公司，吉林 長春 130062)

建立高效的應(yīng)用高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀、全自動(dòng)凈化在線濃縮儀及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定植物源性食品中甲基托布津殘留量的檢測(cè)方法。試樣經(jīng)高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀，用乙腈均質(zhì)提取，經(jīng)全自動(dòng)凈化在線濃縮儀(凝膠色譜柱、固相萃取柱)凈化、在線濃縮后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀定量定性分析，外標(biāo)法定量，液相流動(dòng)相為甲醇-水，采用電噴霧離子源，定性離子對(duì)為m/z 343.0＞151.1、m/z 343.0＞192.1，定量離子對(duì)為m/z 343.0＞151，添加0.01～10.0mg/kg的甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的回收率為88.4%～97.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.3%～2.9%之間，最低檢出限為0.01mg/kg。該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、高通量、全自動(dòng)、快速高效，可應(yīng)用于植物源性食品的甲基托布津殘留量檢測(cè)。

高通量全自動(dòng)；植物源性食品；甲基托布津

甲基托布津(thiophanate-methyl，化學(xué)名為1,2-二(3-甲氧碳基-2-硫脲基)苯，CAS號(hào)為 23564-05-8，結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種廣譜性內(nèi)吸低毒殺菌劑，純品為無色結(jié)晶，原粉(含量約93%)為微黃色結(jié)晶，比重1.5(20℃)、熔點(diǎn)172℃(分解)、蒸氣壓949.1×10-8Pa(25℃)。幾乎不溶于水，可溶于丙酮、甲醇、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，對(duì)酸、堿穩(wěn)定。它最初由日本曹達(dá)株式會(huì)社研制開發(fā)，對(duì)多種植物病害有預(yù)防和治病作用，其內(nèi)吸性比多菌靈強(qiáng)。甲基托布津按其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬取代苯類殺菌劑。

關(guān)于植物源性食品中甲基托布津殘留量的檢測(cè)方法，目前有氣相色譜法[1-3]、紫外分光光度法[4]、氣相色譜法[5-6]，這些方法存在過程冗長、試劑用量較大、靈敏度低、檢測(cè)品種單一、檢測(cè)低線不能滿足國內(nèi)外限量要求[7]、自動(dòng)化程度較低、無法定性確證等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在借鑒國際國內(nèi)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法[8-12]基礎(chǔ)上，建立具有特異性強(qiáng)、敏感性高、高通量、全自動(dòng)、快速高效等特點(diǎn)，完全符合國內(nèi)、國際植物源性食品安全的甲基托布津殘留量檢測(cè)方法。

圖1 甲基托布津分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Thiophanate-methyl molecule structure

1 材料與方法

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

除有特殊規(guī)定外，試劑均為分析純，水均為二次蒸餾水。乙腈、甲醇、甲苯(均為色譜純)；氫氧化鈉溶液(1.0mol/L)：稱取4.0g氫氧化鈉，用水溶解并定容至100mL；乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)；甲苯-乙腈(3:1，V/V)；甲醇-水(1:1，V/V)；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取100mg(精確到0.1mg)的甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇-水(1:1，V/V)溶解并定容于100mL容量瓶中；配制成質(zhì)量濃度為1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要再用甲醇-水(1:1，V/V)稀釋成適用質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

API4000液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀[配有電噴霧(ESI)源] 美國A&B應(yīng)用生物技術(shù)有限公司；FASTH21高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀 北京測(cè)迪科技有限公司；PreLinc全自動(dòng)凈化色譜儀(配有凝膠凈化、固相萃取、在線濃縮系統(tǒng)) 北京綠綿巨貿(mào)有限公司；離心機(jī)(5000r/min)；渦旋混勻器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮?dú)獯蹈蓛x；電子天平(感量0.001g)；0.20μm有機(jī)濾膜。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 提取

稱取5.0g(精確至0.01g)樣品于50mL塑料離心管中，加入5mL水，放入高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀進(jìn)行自動(dòng)勻漿，再加入適量氫氧化鈉溶液，調(diào)試液的pH7～8，并加入2.0g氯化鈉，于渦旋混勻器上混勻。先用10mL乙腈提取一次，渦旋混合3min，以5000r/min離心2min。取上層清液于另一25mL離心管中，殘?jiān)偌尤?mL乙腈，重復(fù)提取一次，合并上清液。提取液在氮?dú)獯蹈蓛x上40℃條件下濃縮至近1mL。加入10mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，近干，加入10mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)，待凈化。

1.3.2 凝膠色譜(GPC)、固相萃取(SPE)凈化

1.3.2.1 凝膠色譜條件

凝膠凈化柱：Bio Beads S-X3[700mm×25mm(i.d.)]；流動(dòng)相：乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)；流速：4.7mL/min；樣品定量環(huán)：10mL；預(yù)淋洗時(shí)間：10min；凝膠色譜平衡時(shí)間：5min；收集時(shí)間：21～28min。

1.3.2.2 凝膠色譜凈化步驟

將10mL待凈化液按上述條件進(jìn)行凈化，收集組分于40℃在線濃縮至1mL，待固相萃取凈化。

1.3.2.3 固相萃取(SPE)凈化

將氨基活性碳復(fù)合固相萃取小柱連接到全自動(dòng)凈化色譜儀，設(shè)定凈化程序：用6mL甲苯-乙腈溶液預(yù)淋洗，加入1mL凝膠凈化濃縮液(1.3.2.2節(jié))，控制流速為1.5mL/min，并用20mL甲苯-乙腈溶液洗脫，待在線濃縮。

1.3.2.4 在線濃縮

收集所有流出液，在線濃縮并用甲醇-水溶液定溶至1.0mL，過0.20μm有機(jī)相微孔濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Aglient XDB C18[150mm×2.1mm(i.d.)，3.5μm]；流動(dòng)相：甲醇溶液；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：1 0μL；柱溫：3 0℃。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧(ESI)離子源，正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MR M)。其他參數(shù)：電噴霧電壓(IS)：5500V；離子源溫度(TEM)：450℃；輔助氣1壓力(GS1)：40psi；輔助氣2壓力(GS2)：50psi；氣簾氣壓力(CUR)：15psi；碰撞氣(CAD)：7psi；入口電壓(EP)和出口電壓(CXP)：10V；氣簾氣(CUR)：10psi。檢測(cè)離子對(duì)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

表1 甲基托布津的選擇離子對(duì)和優(yōu)化參數(shù)Table 1 Selected ion pairs and optimized parameters for the mass spectral analysis of thiophanate methyl

1.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別從質(zhì)量濃度為1000μg/mL的標(biāo)液中吸取0.1、0.5、2.5、4.0、5.0mL，用50mL空白基質(zhì)溶液定容，此時(shí)溶液中甲基托布津質(zhì)量濃度分別為0.20、1.00、5.00、8.00、10.00μg/mL。注入進(jìn)樣瓶中進(jìn)行色譜測(cè)定，按1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行分離，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸收峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以保留時(shí)間及離子對(duì)m/z 343.0＞151.1、m/z 343.0＞192.1進(jìn)行定性，離子對(duì)m/z 343.0＞151.1為定量離子，外標(biāo)法定量。

1.6.2 計(jì)算

試樣中甲基托布津的含量/(mg/kg)按下式計(jì)算：

式中：As為標(biāo)樣溶液中甲基托布津的峰面積；A為試樣溶液中甲基托布津的峰面積；Cs為所用甲基托布津標(biāo)樣溶液的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；V為樣品最終定容體積/mL；m為試樣的質(zhì)量/g。

1.6.3 空白實(shí)驗(yàn)

除不稱取樣品外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。

1.7 定性測(cè)定

圖2 甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)色譜圖Fig.2 LC/MS/MS chromatogram of thiophanate methyl standard in MRM mode

利用串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定性分析，在上述條件下，甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間為4.66min，甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)色譜圖見圖2。

在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子與同樣條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖中對(duì)應(yīng)的離子相對(duì)豐度，應(yīng)不超過表2中的規(guī)定范圍。

表2 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許相對(duì)偏差Table 2 Maximum allowable standard derivations of relative abundance of ion in qualitative confirmation %

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品種類的確定

甲基托布津主要用于水果、蔬菜的殺菌劑，參與實(shí)驗(yàn)的果菜樣品有蘋果、柑橘、菠菜、黃瓜、白菜、大米、玉米。這7種樣品在植物源性食品中較常見。

2.2 色譜條件優(yōu)化

考察美國Agilent、Waters等不同公司、不同型號(hào)的色譜柱，最終選擇Aglient XDB C18[150mm×2.1mm(i.d.)×3.5μm]，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

考察不同配比的甲醇-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)不同比例的流動(dòng)相對(duì)出峰時(shí)間并沒有太大影響，考慮到實(shí)際使用，最終確定甲醇:水=50:50(V/V)為最佳流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)甲基托布津的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧(ESI)離子源，在正離子模式下對(duì)甲基托布津進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到甲基托布津的分子離子峰，選擇合適的分子離子峰進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎片分析，得到特征子離子信息，根據(jù)其質(zhì)譜圖中的碎片離子選擇豐度相對(duì)較高和相對(duì)分子質(zhì)量較大的碎片，選擇合適的離子對(duì)進(jìn)行電噴霧電壓(IS)、離子源溫度(TEM)、碰撞氣(CAD)、入口電壓(EP)、出口電壓(CXP)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，使甲基托布津的分子離子與特征碎片離子的靈敏度達(dá)到最大時(shí)定為最佳質(zhì)譜條件。優(yōu)化后定性離子對(duì)為m/z 343.0＞151.1、343.0＞192.1，定量離子對(duì)為m/z 343.0＞151.1。

2.4 線性范圍、最低檢出限、回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明，在0.01～10.0μg/mL含量范圍內(nèi)各物質(zhì)的峰面積(Y)與含量(X)具有良好的線性關(guān)系?；貧w方程和線性相關(guān)系數(shù)(r)為Y=206851X＋10478.6(r=0.9998)。

對(duì)10個(gè)陰性的水樣進(jìn)行測(cè)定，得出響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)差，按最小檢出限為空白值3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，將峰面積換算成被測(cè)物濃度，甲基托布津的最小檢出限為0.01mg/kg。

進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)時(shí)，甲基托布津的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)采用樣品基質(zhì)溶液進(jìn)行溶解及配制。甲基托布津的標(biāo)準(zhǔn)添加量為0.10mg/kg，按上述的樣品處理和測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)試，方法回收率在88.4%～97.9%之間。

取實(shí)驗(yàn)室制備的含有甲基托布津的飼料樣品，按處理方法進(jìn)行提取測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，以實(shí)際測(cè)定濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表征方法的精密度。甲基托布津峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.3%～2.9%之間。

2.5 LC-MS/MS確證分析

本方法采用串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)，利用串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，使用保留時(shí)間和兩對(duì)離子對(duì)進(jìn)行確證，滿足國際上對(duì)物質(zhì)確證的得分要求，在色譜圖中相應(yīng)的保留時(shí)間范圍內(nèi)未見干擾，可以根據(jù)峰面積，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。定性離子對(duì)為m/z 343.0＞151.1、343.0＞192.1，定量離子對(duì)為m/z 343.0＞151.1。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)近期(2010年3月—2010年11月)菜市場(chǎng)交易的植物源性食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，總計(jì)檢測(cè)了38批植物源性樣品，包括玉米、黃瓜、青椒西蘭花等品種，結(jié)果有2批樣品檢測(cè)出甲基托布津，甲基托布津殘留量分別為11.0、9.2mg/kg。

[1] 日本甘薯中多菌靈、托布津、甲基托布津、苯菌靈(總量)的殘留限量規(guī)定[EB/OL]. (2006-10-19)[2010-04-15]. http://db.foodmate.net/pesticide/read_ncxl.php?pid=78883.

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[4] 衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所. GB/T 5009.188—2003 蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測(cè)定[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

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High-throughput Automated Instrumental Analysis of Thiophanate-methyl Residue in Plant-derived Foods

LI Ai-jun1，WANG Ming-tai1，WU Lian-peng1，MU Jun1，LU Li-jun1，ZHOU Xiao1，HU Ting-ting1，ZHAO Dong-han2，YAO Tian-ling3
(1. Jilin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China；2. Jinlin Agricultural University, Changchun 130118, Chian；3. Changchun Dacheng Maize Development Company, Changchun 130062, China)

An efficient detection method for thiophanate methyl residue in plant-derived foods was established by combing a high-throughput automated homogenizer, an automatic online purification and concentration system and a liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Samples were homogenized with acetonitrile on a high-throughput automated homogenizer,purified using an automatic online purification (gel chromatographic and solid phase extraction column) system, online concentrated and detected using a liquid chromatography-tandem mass spectrometer. The quantification of thiophanate methyl was carried out using the external standard method. The detection conditions were: acetonitrile-water (gradient) as mobile phase, ESI as ionization method, qualitative ion pairs of m/z 343.0＞151.1 and 343.0＞192.1, quantitative ion pairs of m/z 343.0＞151.1.With the addition of 0.01 to 10.0 mg/kg of thiophanate standard to samples, the recovery rate was between 88.4% and 97.9% and the relative standard deviations (RSDs) varied from 1.3% to 2.9%. The detection limit of the established method was 0.01 mg/kg.

high-throughput automated system；plant-derived foods；thiophanate-methyl residue

TS207.53

A

1002-6630(2011)10-0133-04

2010-07-14

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目(2009B160)

李愛軍(1968—)，男，研究員，碩士，主要從事食品分析、農(nóng)殘檢驗(yàn)研究。E-mail：liaj@jlciq.gov.cn