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      恩諾沙星時間分辨熒光免疫分析方法的建立

      2011-10-28 07:32:50趙莉莉王曉嵐宓曉黎陸茂林
      食品科學 2011年10期
      關(guān)鍵詞:恩諾沙星抗體

      趙莉莉,黃 飚,王曉嵐*,宓曉黎,金 堅,陸茂林

      (1.江南大學醫(yī)藥學院,江蘇 無錫 214122;2.江蘇省微生物研究所有限責任公司,江蘇 無錫 214063;3.江蘇省原子醫(yī)學研究所,江蘇 無錫 214063)

      恩諾沙星時間分辨熒光免疫分析方法的建立

      趙莉莉1,2,黃 飚3,王曉嵐1,*,宓曉黎2,金 堅1,陸茂林2

      (1.江南大學醫(yī)藥學院,江蘇 無錫 214122;2.江蘇省微生物研究所有限責任公司,江蘇 無錫 214063;3.江蘇省原子醫(yī)學研究所,江蘇 無錫 214063)

      目的:采用時間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技術(shù)建立高靈敏的恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)快速檢測方法。方法:以包被抗原(ENR-OVA)包被微孔板,與游離的恩諾沙星共同競爭抗恩諾沙星抗體,以銪(Eu3+)標記的羊抗兔抗體進行示蹤。結(jié)果:方法的批內(nèi)變異系數(shù)小于10%、批間變異系數(shù)小于15%,平均回收率為91.62%,靈敏度為5ng/L,可測范圍為0.01~100μg/L,ED20、ED50和ED80分別為0.088、3.40μg/L和32.81μg/L。結(jié)論:ENR-TRFIA方法穩(wěn)定性好、可測范圍寬,具有很好的應用前景。

      恩諾沙星;時間分辨熒光免疫分析;獸藥殘留

      人工合成的新型抗菌藥物恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)是第三代氟喹諾酮類藥物(FQNs)之一,在獸醫(yī)學中很快取得廣泛應用[1-2]。但長期應用ENR所產(chǎn)生的不良反應、畜禽產(chǎn)品中的殘留以及在環(huán)境中的生態(tài)效應等方面的問題已引起廣泛關(guān)注[3-7]。許多國家和組織等都將其列入限制使用的獸藥范圍,并制訂出相應的最高殘留限量[8]。目前,美國已經(jīng)禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用FQNs;歐盟對ENR在畜禽肌肉和內(nèi)臟中的殘留限量作了嚴格規(guī)定,要求ENR和環(huán)丙沙星總量的最高殘留限量(MRL)為30μg/kg,日本2006年修改的恩諾沙星殘留限量標準中明確限定此類藥物在水產(chǎn)品中的最高限量為100μg/kg;我國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局規(guī)定恩諾沙星在動物肌肉、肝臟中的最大殘留限量分別為100、200μg/kg。因此加強對該藥在動物性食品中的殘留檢測和監(jiān)督非常必要。

      目前對于恩諾沙星的檢測多采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)等[9-11]理化檢測方法,但這些方法所需設備昂貴、操作繁瑣且靈敏度有限。近年來關(guān)于免疫分析的方法也有報道,應用最廣的為酶聯(lián)免疫法[12-15],但由于酶聯(lián)免疫法檢測范圍有限,且標記物酶易失活,底物見光易分解,受環(huán)境影響較大,一定程度上限制了它的應用。

      本研究采用時間分辨熒光免疫分析法(time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)建立恩諾沙星的高靈敏的檢測方法,該法具有靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定和定量分析量程寬及無放射性污染等優(yōu)點,應全面完善其應用基礎研究,并建立相關(guān)的檢測試劑盒,以滿足國內(nèi)食品安全檢測市場的迫切需要。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      ENR人工抗原(ENR-OVA)和兔抗ENR多克隆抗體 自制;ENR標準品 中國藥品生物制品檢定所;Eu3+標記盒 美國Perkin-Elmer公司;親和層析純化的羊抗兔IgG、牛血清白蛋白(BSA) 美國Sigma公司;PD-10柱、Sepharose CL-6B柱 美國Pharmacia公司。

      去離子超純水、增強液、洗滌液 自配;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;ELISA試劑盒 北京望爾生物技術(shù)有限公司。

      1.2 儀器與設備

      AutoDELFIA-1235全自動TRFIA檢測儀 美國EG&G-Wallac公司;3550-UV酶標儀 美國Bio-Rad公司。

      1.3 方法

      1.3.1 Eu3+-羊抗兔抗體的制備

      取0.5mg羊抗兔抗體,經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件,洗脫液為含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5緩沖液。收集蛋白峰,濃縮后取0.3mg羊抗兔抗體,加入含0.1mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)凍干粉的小瓶中,30℃磁力攪拌反應20h。反應液經(jīng)用80mmol/L Tris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1cm×40cm)層析,A280監(jiān)測收集蛋白峰,稀釋后分裝凍干保存。

      1.3.2 試劑配制

      ENR標準品:從ENR母液中稀釋ENR,質(zhì)量濃度分別為0.00、0.01、0.50、5.00、20.00、100.00μg/L,稀釋液和零質(zhì)量濃度點均為蒸餾水。

      分析緩沖液:8mmol/L NaCl、0.1% BSA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriamine pentoacetic acid,DTPA)、100mmol/L吐溫-80和0.1% NaN3的Tris-HCl(50mmol/L,pH7.8)。

      1.3.3 固相抗原的制備[16]

      將包被抗原ENR-OVA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6緩沖液稀釋至所需質(zhì)量濃度的包被液,96孔微孔板各孔加100μL,4℃放置過夜。棄去包被液,沖洗3次,加200μL含3g/L BSA的上述緩沖液封閉,4℃放置過夜。棄去封閉液,真空抽干,板條密封后置-20℃冷凍保存。

      1.3.4 樣品處理

      分別稱取(4±0.04)g鰻魚試樣置于50mL離心管中,加乙腈-0.1mol/L氫氧化鈉溶液12mL,振蕩混合5min,4000r/min離心5min;移取上清液6mL于50mL離心管中,加0.02mol/L磷酸鹽緩沖液6mL,再加二氯甲烷7mL,振蕩5min,4000r/min離心5min,取下層有機相6mL于10mL試管中,于50℃水浴下氮氣吹干;加0.02mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL,渦動混勻2min,加正己烷1mL,渦動混勻30s,4000r/min離心5min;取下層清液50μL分析。稀釋倍數(shù)為0.5倍。

      1.3.5 檢測步驟

      從-20℃冰箱中取出ENR-OVA板條,加入50μL/孔ENR標準品或處理好的樣品,然后加入分析緩沖液稀釋的兔抗ENR抗體,50μL/孔,37℃恒溫振蕩孵育1h,洗滌3次后,加入分析緩沖液稀釋的Eu3+-羊抗兔抗體100 μL/孔,37℃恒溫振蕩孵育0.5h,洗滌6次后,加增強液200μL/孔,振蕩5min后,用時間分辨免疫檢測儀測定,繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算樣品中ENR含量。

      1.3.6 間接競爭ENR-TRFIA方法的考核

      1.3.6.1 靈敏度

      計算10組標準曲線零質(zhì)量濃度點計數(shù)的平均值(x)和標準差(s),從標曲線中找到x-2s所得值,對應質(zhì)量濃度即為檢測靈敏度。

      1.3.6.2 穩(wěn)定性

      比較計數(shù)為零質(zhì)量濃度點計數(shù)的20%、50%和80%時的效應值(effective dose,ED)ED20、ED50和ED80對應的質(zhì)量濃度/(μg/L),根據(jù)長期多次和加速試驗測定判斷劑量反應曲線的位置漂移來考核方法的穩(wěn)定性。

      1.3.6.3 回收率

      在確定本底的鰻魚中分別添加5個濃度水平的恩諾沙星標準品,進行間接競爭TRFIA檢測。計算實測值與理論值的比值。

      1.3.6.4 精密度

      用標準品稀釋液配制不同質(zhì)量濃度的樣品,觀察批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)。

      1.3.6.5 特異性實驗

      按照1.3.5節(jié)檢測步驟進行ENR-TRFIA檢測,繪制標準曲線。根據(jù)各質(zhì)量濃度點和零質(zhì)量濃度點的熒光計數(shù)值計算抑制率,并以抑制率和恩諾沙星質(zhì)量濃度的常用對數(shù)值作圖,半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為抑制率達到50%時所對應的恩諾沙星質(zhì)量濃度。以恩諾沙星類似的其他喹喏酮類藥物標準品為競爭物,按照同樣操作條件進行與恩諾沙星抗體的競爭實驗,分別計算各藥物的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50,并根據(jù)下式計算交叉反應率:交叉反應率/%=[IC50(恩諾沙星)/類似藥物的IC50]×100。重復測定3次,取平均值。

      1.3.6.6 基質(zhì)效應性(健全性)

      考察樣品介質(zhì)對方法的干擾。正常的健全性實驗所得出的曲線應該與標準曲線重合或者平行。若存在干擾物質(zhì),則實驗數(shù)值不成比例增加。取含ENR的鰻魚樣品,按一系列比例稀釋,將稀釋后的樣品用ENR-TRFIA測量,將測得結(jié)果繪制成曲線。

      1.3.6.7 方法比較

      取鰻魚樣品若干份,分別用ENR-TRFIA和商品化ENR-ELISA試劑盒同時檢測樣品,比較兩種檢測方法的相關(guān)性。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 Eu3+-羊抗兔抗體的理化和免疫學鑒定

      Eu3+標記物經(jīng)Sepharose CL-6B層析,收集第一洗脫峰,如圖1所示。以Eu3+標準產(chǎn)品為參考,Eu3+-羊抗兔抗體第一洗脫峰的Eu3+濃度為36.7μmol/L、蛋白質(zhì)濃度為3.2μmol/L,即平均每個羊抗兔抗體分子上連接了11.5個Eu3+。

      圖1 A280檢測Eu3+ IgG Sepharose CL-6B洗脫峰Fig.1 Elution profile of Eu3+ labeled IgG from a Sepharose CL-6B column

      2.2 包被抗原和抗體工作質(zhì)量濃度的選擇

      取不同質(zhì)量濃度的ENR包被抗原板條,依次加入ENR標準品或樣品,然后每孔依次加入抗ENR抗體(1:20000),進行ENR-TRFIA檢測,繪制標準曲線,選擇零質(zhì)量濃度點計數(shù)高且曲線斜率大(靈敏度高)的包被抗原質(zhì)量濃度,結(jié)果如圖2所示。確定包被抗原的質(zhì)量濃度為100μg/L。

      圖2 不同包被抗原質(zhì)量濃度條件下的ENR-TRFIA標準曲線Fig.2 Effect of envelope antigen concentration on calibration curve of ENR-TRFIA

      用不同質(zhì)量濃度的抗ENR抗體建立檢測方法,以各稀釋度抗ENR抗體的熒光計數(shù)(B)與最高質(zhì)量濃度抗ENR抗體的熒光計數(shù)(B0)的比值(B/B0,即結(jié)合率)為縱坐標、抗體稀釋比例為橫坐標繪制曲線,結(jié)果見圖3。由于30%~50%抗體結(jié)合率對應的稀釋度為最佳抗體反應稀釋度,由圖3得出此范圍為96000~48000,因此合適的工作質(zhì)量濃度應在此范圍內(nèi),本實驗選擇1:60000倍稀釋。

      圖3 ENR抗體稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of anti-ENR antibody by indirect competitive ENR-TRFIA

      2.3 ENR-TRFIA標準曲線的繪制

      圖4 間接競爭ENR-TRFIA標準曲線Fig.4 Calibration curve of indirect competitive ENR-TRFIA

      間接競爭ENR-TRFIA的結(jié)果經(jīng)Log-Logit函數(shù)數(shù)據(jù)處理所得的標準曲線見圖4。LogitY=ln[Y/(1-Y)],Y=B/B0,式中B0為最大結(jié)合率的熒光計數(shù)值,即零質(zhì)量濃度點的熒光計數(shù)值。以零質(zhì)量濃度點發(fā)光值x-2s后的發(fā)光值在標準曲線上得到的相應值為檢測的靈敏度,方法的靈敏度為5ng/L。由標準點所在的區(qū)間可得,該檢測方法的檢測范圍為0.01~100μg/L。

      2.3.1 方法的穩(wěn)定性

      6條不同時間進行的間接競爭ENR-TRFIA的效應點均值ED20、ED50和ED80分別為0.088、3.40μg/L和32.81μg/L(表1),3個效應點的批間變異系數(shù)(CV)均小于10%,說明劑量反應曲線的位置漂移小,方法的穩(wěn)定性好。將檢測用試劑置于37℃、7d(相當于4℃、6個月)后測定,各質(zhì)量濃度點的結(jié)合率平均下降10.6%,如表2所示,因此說明試劑盒的貨架期可以滿足實際應用的需要。

      表1 標準曲線的ED20、ED50和ED80值的穩(wěn)定性比較Table 1 ED20, ED50 and ED80 of ENR-TRFIA

      表2 方法的破壞性實驗(37℃、7d)Table 2 Destructive test of ENR-TRFIA (37 ℃,7 d)

      2.3.2 方法的回收率

      表3 間接TRFIA測定樣品中ENR的回收率Table 3 Recovery rate of ENR from eel samples determined by TRFIA

      稱取已處理的鰻肉樣品(3.00±0.05)g,分別添加0.1、1.0、10.0、50.0、200.0μg/kg的恩諾沙星標準品,進行回收率的測定,高濃度點稀釋到檢測限范圍內(nèi)再測,結(jié)果如表3所示。各濃度點的回收率分別為73.5%、93.6%、95.8%、107.6%、87.6%,平均回收率為91.62%。

      2.3.3 精密度

      用標準品稀釋液配制3份不同質(zhì)量濃度的標準品,觀察批內(nèi)和批間變異系數(shù),結(jié)果如表4所示。批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%,批間變異系數(shù)均小于15%,該結(jié)果符合免疫分析要求。

      表4 ENR-TRFIA批內(nèi)、批間變異率的考核Table 4 Intra- and inter-assays of ENR-TRFIA

      2.3.4 方法的特異性

      采用間接競爭ENR-TRFIA檢測ENR抗體與其相關(guān)類似物的的交叉反應率,結(jié)果如表5所示。恩諾沙星抗體對其他藥物的交叉反應率低,對恩諾沙星的特異性較好。

      表5 間接TRFIA測定恩諾沙星抗體的特異性Table 5 Specificities of enrofloxacin antibody by TRFIA

      2.3.5 方法的健全性

      圖5 鰻魚樣品稀釋比例與測定值相關(guān)性Fig.5 Correlation between dilution rate and determination results in eel samples

      取含定量ENR的鰻魚樣品,質(zhì)量濃度為1000μg/L,按1:10、1:50、1:200、1:2000、1:100000比例稀釋,將稀釋后的樣品用ENR-TRFIA測量,將測得結(jié)果繪制成曲線,與標準曲線比較。測定結(jié)果如圖5所示。測定結(jié)果呈線性關(guān)系,表示此方法具有較好的健全性。

      2.3.6 方法的相關(guān)性

      用本實驗室建立的ENR-TRFIA方法和國產(chǎn)商品化ENR-ELISA試劑盒同時檢測15份鰻魚樣品,結(jié)果如表6所示。對兩種方法的檢測結(jié)果進行線性回歸分析,相關(guān)系數(shù)為0.9772,表明兩種方法的相關(guān)性很好(圖6)。

      表6 酶聯(lián)免疫法和時間分辨免疫法的樣品檢測值Table 6 Comparative results of determining eel samples by ENR-ELISA and ENR-TRFIA

      圖6 ENR-TRFIA和ENR-ELISA相關(guān)性曲線圖Fig.6 Correlation between ENR-TRFIA and ENR-ELISA in determining eel samples

      3 結(jié) 論

      TRFIA是超微量檢測領域中一項新興的檢測技術(shù)[17],采用非放射性原子(三價稀土離子)標記技術(shù),標記位點多,極大地提高了方法學的靈敏度;標記方法屬原子標記,對生物活性影響??;激發(fā)光和發(fā)射光譜之間Stock位移大,可提高方法學的穩(wěn)定性;相對長的熒光發(fā)射周期可有效避免環(huán)境因素的干擾。采用TRFIA方法建立的試劑盒具有有效期長、操作簡便、靈敏度高、標準曲線量程寬、可全自動操作及應用范圍廣泛等優(yōu)點[18-19]。

      本研究采用稀土離子Eu3+標記技術(shù)建立EN RTRFIA,其檢測的靈敏度較ELISA方法[12]有所增加,可達5ng/L,測量范圍為0.01~100μg/L,向鰻魚樣品中分別添加0.1、1.0、10.0、50.0、200.0μg/kg五個水平的恩諾沙星標準品,平均回收率分別為7 3.5%、93.6%、95.8%、107.6%、87.6%。方法的批內(nèi)變異系數(shù)小于10%,批間變異系數(shù)小于15%。特異性實驗表明恩諾沙星抗體與其他喹諾酮類藥物交叉反應均較低,抗體的特異性很好。從健全性實驗可以看出,待測物質(zhì)的免疫化學性質(zhì)是基本相同的,通過標準品劑量反應曲線可以準確地測定待測物的含量,所以本方法的健全性很好。同批試劑連續(xù)6個月應用分析,發(fā)現(xiàn)標準曲線基本重合,無明顯漂移,非常穩(wěn)定。

      ENR-TRFIA是一種快速、經(jīng)濟、可進行大批量樣品篩查的簡便方法,其在ENR檢測中的應用,將有助于食品安全領域的研究。

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      Establishment of a Time-resolved Fluoroimmunoassay for Measuring Enrofloxacin

      ZHAO Li-li1,2,HUANG Biao3,WANG Xiao-lan1,*,MI Xiao-li2,JIN Jian1,LU Mao-lin2
      (1. School of Medicine and Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;2. Jiangsu Institute of Microbiology Co. Ltd., Wuxi 214063, China;3. Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Wuxi 214063, China)

      A time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) was developed for the rapid and sensitive detection of enrofloxacin(ENR). In indirect TRFIA format, the envelope antigen composed of ENR and ovalbumin (OVA) was coated onto the microplate,and followed by the incubation with free ENR and anti-ENR polyclonal antibody. A goat anti-rabbit IgG conjugated with europium (Eu3+) was used for the detection. The intra-assay CV (coefficient of variation) of the developed method was less than 10% and the inter-assay CV less than 15%. The average recovery rate was 91.62% and the sensitivity was 5 ng/L. The antibody had a linear response over the range from 0.01μg/L to 100μg/L. The ED20, ED50 and ED80 (80%, 50% and 20% effective doses)were 0.088, 3.40 μg/ L and 32.81 μg/ L, respectively. The high stability and broad detection range allows the TRFIA method to have promising application prospects.

      enrofloxacin;time-resolved fluoroimmunoassay;veterinary drug residues

      R155.5

      A

      1002-6630(2011)10-0110-05

      2010-06-30

      國家“863”計劃項目(2008AA10Z425)

      趙莉莉(1984—),女,碩士研究生,研究方向為食品安全評估。E-mail:zmf743@126.com

      *通信作者:王曉嵐(1962—),女,副教授,博士,研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學。E-mail:wangxl@jiangnan.edu.cn

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