張春林，敖宗華，炊偉強(qiáng)，沈才洪，陶文沂,*，張宿義

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用快速測(cè)定大曲中的揮發(fā)性風(fēng)味成分

張春林1，敖宗華2，炊偉強(qiáng)1，沈才洪2，陶文沂1,*，張宿義2

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

為探討大曲中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法(HS-SPME-GC-MS)分析瀘州老窖中高溫大曲的揮發(fā)性成分，考察萃取頭、萃取時(shí)間、萃取溫度對(duì)大曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取的影響。結(jié)果表明：采用50/30μm碳分子篩/聚二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR on PDMS)纖維頭在50℃條件下對(duì)大曲樣品頂空吸附30min，萃取效果最好；大曲樣品的分析表明，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中含量較高的是醇類、酯類和酮類化合物，另外還含有一些吡嗪類化合物。該方法對(duì)大曲中常見(jiàn)揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定有良好的重復(fù)性和回收率，方便快速。

頂空固相微萃取法；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；瀘州老窖大曲；揮發(fā)性風(fēng)味化合物

大曲是以單一小麥或小麥、大麥和豌豆混合物為原料，經(jīng)粗粉碎后加水壓成磚狀曲坯，人工控制在一定的溫度、濕度條件下培育而成的粗酶制劑[1]。它是釀酒發(fā)酵的動(dòng)力，用于蒸餾酒的釀造。目前許多名優(yōu)白酒就是利用大曲作為釀酒的原料。大曲微生物區(qū)系以霉菌占大多數(shù)，酵母菌和細(xì)菌比較少[2]。在大曲制造過(guò)程中微生物的代謝產(chǎn)物和原料的分解產(chǎn)物直接或間接地構(gòu)成了白酒的風(fēng)味物質(zhì)，使白酒具有各種不同的獨(dú)特的風(fēng)味[3]。因此，大曲還是生香劑。不少專家認(rèn)為，大曲中富含大量香味前驅(qū)物質(zhì)，因此，大曲本身就是一種香味物質(zhì)的富集物，所謂的曲香正是一種表現(xiàn)[4]。然而目前對(duì)于大曲中的香味物質(zhì)研究較少。

分析樣品中的香味物質(zhì)，通常要對(duì)香氣成分進(jìn)行濃縮預(yù)處理。傳統(tǒng)的濃縮預(yù)處理方法有液-液萃取法、頂空法、吹掃捕集法、同時(shí)蒸餾萃取法和固相萃取法[5]。這些方法都不同程度地存在某些缺點(diǎn)，或費(fèi)用太高，或樣品量過(guò)多、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，或使用的是對(duì)人體有害的昂貴的有機(jī)溶劑，對(duì)操作者造成潛在的危害，還可能在濃縮過(guò)程中丟失揮發(fā)性物質(zhì)。與傳統(tǒng)的風(fēng)味物質(zhì)抽提技術(shù)相比，固相微萃取(SPME)簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)安全、無(wú)溶劑、選擇性好且靈敏度高，可直接與氣相色譜-質(zhì)譜、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳儀等聯(lián)用，集采樣、萃取、進(jìn)樣于一體，大大加快了分析檢測(cè)的速度[6-7]，近年來(lái)該技術(shù)在食品風(fēng)味分析中應(yīng)用越來(lái)越廣泛[8-12]。

本研究采用HS-SPME與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用的方法，優(yōu)化頂空固相微萃取法參數(shù)，探討HS-SPME用于分離大曲中香氣物質(zhì)的可行性，對(duì)大曲樣品的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性定量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大曲樣品及其前處理：瀘州老窖中高溫大曲優(yōu)級(jí)曲；將采集的到的整塊大曲粉碎后并全部過(guò)40目篩，混合均勻后，取0.5g大曲樣品放入頂空瓶中再加入飽和NaCl溶液5mL蓋上瓶蓋。

Trace MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Finnigan公司；DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，0.25 μm)、萃取裝置：SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄、萃取頭(85μm PA、100μm PDMS、75μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR on PDMS) 美國(guó)Supelco公司；Turbo Matrix TD熱脫附進(jìn)樣器 美國(guó)Perkin Elmer公司。頂空進(jìn)樣瓶(15mL)中國(guó)安譜公司；RCT-Basic加熱磁力攪拌器 日本島津公司。

1.2 頂空固相微萃取條件

萃取頭的老化：第一次使用時(shí)50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口270℃老化1h，75μm CAR/PDMS萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口300℃老化1h，85 μm PA萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口280℃老化1h，100μm PDMS萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口250℃老化0.5h。

萃取條件：50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取纖維頭，于50℃插入加入飽和 NaCl 5mL的大曲樣品(0.5g)頂空吸附30min，于250℃解吸5min后進(jìn)行GC-MS分離鑒定。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)； 載氣為He，流速1mL /min； 程序升溫：起始溫度40℃，保持3min，以5℃/min 升溫速率升至80℃，最后以10℃/min升至230℃/min 保持7min；汽化室溫度250℃；不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(E I)離子源，電子能70eV，發(fā)射電流200μA，電子倍增器電壓350V，離子源溫度200℃， 接口溫度250℃，質(zhì)量范圍33～450u。

1.4 定性與定量分析

定性：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件完成，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索的同時(shí)與NIST譜庫(kù)(107000個(gè)化合物的數(shù)據(jù))和Wiley譜庫(kù)(320000個(gè)化合物的數(shù)據(jù))相匹配，只有當(dāng)正反匹配度均大于800(最大值為1000)的鑒定結(jié)果才予以確認(rèn)。

定量：選擇2-辛醇為內(nèi)標(biāo)(終質(zhì)量濃度10ng/mL)，大曲樣品中鑒定的化合物質(zhì)以與2-辛醇質(zhì)量濃度之比計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取纖維頭的篩選

選用4種萃取頭在相同的吸附條件(50℃吸附30min)和解吸條件(250℃解吸5min)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從表1來(lái)看，50/30μm DVB/CAR on PDMS的總的峰面積為5.5×108，幾乎是85μm PA總峰面積的7.6倍，100μm PDMS的12.0倍和75 μ m CAR /PDMS的1.9倍，說(shuō)明50/30μ m DVB/CAR on PDMS的吸附能力比其他的萃取頭強(qiáng)，這和文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。從檢出的有效化合物的個(gè)數(shù)來(lái)看，50/30μm DVB/CAR/PDMS檢出了55種化合物，而75μm CAR/PDMS檢出了47種化合物，比單一組分涂層的85 μm PA(35種化合物) 和100μm PDMS(38種化合物)要多。這主要是因?yàn)檩腿☆^涂層的極性不同的緣故[14]。萃取頭對(duì)所分析的化合物有選擇性，對(duì)大曲樣品而言，50/30 μm DVB/CAR on PDMS 復(fù)合涂層的萃取頭更加適合，不僅分離出的化合物比較全面，而且風(fēng)味強(qiáng)度也很大，色譜分析響應(yīng)值較高，因而選擇作為實(shí)驗(yàn)用萃取頭[10,15]。

表1 不同萃取頭的萃取效果Table 1 Effect of fiber type on volatile extraction

2.2 萃取時(shí)間的選擇

選用50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，萃取溫度為50℃的條件下，比較5個(gè)不同吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響。由圖1可知，萃取時(shí)間延長(zhǎng)，萃取物總峰面積增加。吸附時(shí)間從10min增加到30min時(shí)峰面積增加較明顯；當(dāng)吸附時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)到50min時(shí)，總峰面積變化幅度不大，趨于平衡，可能此時(shí)存在吸附-解吸附平衡。因此選擇吸附時(shí)間為30min，此時(shí)間正好與GCMS分析樣品所需的時(shí)間比較接近，從而提高了單位時(shí)間內(nèi)樣品分析的效率。

圖1 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Effect of time on volatile extraction

2.3 萃取溫度的選擇

萃取溫度對(duì)萃取效果的影響具有兩面性：一方面，溫度升高有利于吸附，尤其對(duì)頂空固相微萃?。涣硪环矫?，溫度升高又會(huì)增加萃取頭固有組分的解吸，從而降低萃取頭對(duì)被分析組分的吸附能力。選用50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，萃取時(shí)間為30min的條件下，由圖2可明顯看到，吸附溫度升高時(shí)吸附量有所增加，但是，萃取溫度由50℃提高到60℃時(shí)總峰面積增加幅度不大，而檢出的有效化合物數(shù)目在減少，所以選擇50℃作為吸附溫度，此時(shí)檢出的化合物最多，所吸附的樣品量足夠用于GC-MS分析。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of temperature on volatile extraction

2.4 萃取方法的有效性驗(yàn)證

采用上述優(yōu)化的分析操作條件，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，考察頂空固相微萃取法在分析大曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)時(shí)的重復(fù)性和回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，經(jīng)計(jì)算，組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)最大為39.4%，最小為1.9%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.9%，說(shuō)明將頂空固相微萃取技術(shù)用于大曲風(fēng)味物質(zhì)的分析重復(fù)性良好。

表2 大曲樣品中鑒定的揮發(fā)性風(fēng)味成分和含量(n=3)Table 2 Identified volatiles and their contents in Daqu sample(n= 3)

在大曲樣品中加入幾種具有代表性的揮發(fā)性風(fēng)味成分，與不加入的大曲樣品同時(shí)測(cè)定，按照加標(biāo)回收率的方法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。大曲樣品中幾種具有代表性的風(fēng)味組分回收率范圍在87.5%～114.0%，幾種代表性化合物的回收率都較高，說(shuō)明該法具有很好可靠性和準(zhǔn)確性。

表3 大曲樣品中部分揮發(fā)性風(fēng)味成分的回收率Table 3 Recoveries of several of identified volatiles from spiked Daqu sample

2.5 大曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析

圖3 大曲中揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion chromatograms of volatiles in Daqu sample

從表2分析結(jié)果來(lái)看，大曲的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為醇類(28.6%)、酯類(16.0%)、酮類(8.9%)、醛類(7.1%)，另外吡嗪類(17.9%)在大曲中占有很高的含量。從單個(gè)化合物的含量上看，含量最高的化合物是2-戊醇，其次是苯乙醇，其他的重要微量揮發(fā)性化合物依次是乙酸乙酯、四甲基吡嗪、己醛、十六酸甲酯、3-甲基丁醇、正已醇、三甲基吡嗪、亞油酸甲酯、丁酸甲酯等。醇類可以產(chǎn)生使人愉快的氣味，3-甲基丁醇、苯乙醇本身還具有花草和水果的香氣；酯類物質(zhì)一般都具有水果香，乙酸乙酯在大曲中含量較高，可能對(duì)曲香形成有有較大貢獻(xiàn)；吡嗪類物質(zhì)一般都具有烘焙和堅(jiān)果香，可能與大曲發(fā)酵過(guò)程中頂溫會(huì)超過(guò)50℃，由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生；分析對(duì)曲香形成有較大貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)，還需要利用GC-O法進(jìn)一步研究[16-17]。范文來(lái)等[15]曾研究過(guò)醬香型白酒生產(chǎn)大曲，由于大曲生產(chǎn)工藝的明顯不同，特別是生產(chǎn)工藝的溫度和時(shí)間不同，濃香型白酒大曲中檢測(cè)到的揮發(fā)性成分要顯著少于醬香型白酒大曲。圖3為瀘州老窖中高溫大曲在最佳條件下使用HSSPME檢測(cè)到的微量揮發(fā)性成分的GC-MS圖。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速、簡(jiǎn)單、樣品用量少的測(cè)定大曲樣品中揮發(fā)性成分的頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，用該法能較好地萃取大曲樣品中的醇類、酯類、醛類、酮類、吡嗪等揮發(fā)性風(fēng)味成分。對(duì)其中醇類、酯類和吡嗪類等具有代表性的揮發(fā)性成分測(cè)定的重復(fù)性良好，加標(biāo)回收率也較高。說(shuō)明該法可較準(zhǔn)確地用于大曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的定量分析。為研究大曲風(fēng)味，提高其質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，并為濃香型白酒香味成分的來(lái)源提供參考依據(jù)。

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Rapid Analysis of Volatile Compounds in Daqu by Headspace Solid-phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHANG Chun-lin1，AO Zong-hua2，CHUI Wei-qiang1，SHEN Cai-hong2，TAO Wen-yi1,*，ZHANG Su-yi2
(1. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Luzhou Laojiao Co. Ltd., Luzhou 646000, China)

In order to analyze the composition of volatile compounds in the Luzhou Laojiao Daqu by headspace solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography mass spectrometry detection (HS-SPME-GC-MS), the effects of SPME fiber type, adsorption time, and extraction temperature on volatile extraction were investigated. Using a 50/30 μm DVB/CAR on PDMS fiber for 30 min headspace adsorption at 50 ℃ provided optimum extraction for the Daqu. Then the fiber was introduced into the injection port of the GC-MS system (at 250 ℃ for 5 min). Fifty-five compounds were isolated and identified,among which alcohols, esters, and ketones were the prominent ones. In addition, some pyrazines were also found. In conclusion,the method is simple, fast and accurate with high reproducibility and sensitivity.

headspace solid-phase microextraction (HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；Luzhou Laojiao Daqu；volatiles

TS261.2

A

1002-6630(2011)10-0137-04

2010-06-20

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2010SZ0032)；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2008年度開放課題(NJ2009-01)

張春林(1982—)，男，博士研究生，主要從事發(fā)酵工程、風(fēng)味化學(xué)研究。E-mail：zcl818075@163.com

*通信作者：陶文沂(1946—)，男，教授，博士，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：wytao1946@163.com