Omi/HtrA2和caspase-7在喉癌組織中的表達及相關性

李 珂，郝 艷，王建亭，馬 敏 (長治市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，長治 06000;長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院耳鼻咽喉科;首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院耳鼻咽喉科;

*通訊作者，E-mail:tingjianwang@yahoo.com.cn)

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡及增殖調節(jié)的失控密切相關，其中細胞凋亡在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。促凋亡因子Omi/HtrA2對多種腫瘤細胞具有促凋亡效應，caspase-7是位于凋亡下游的重要效應蛋白，其在凋亡途徑中發(fā)揮的重要作用早已引起人們的關注。本研究通過觀察喉鱗狀細胞癌中Omi/HtrA2和caspase-7蛋白的表達以及二者與臨床病理特征相關性之間的關系，探討其與喉癌發(fā)生、發(fā)展之間的關系，為喉癌診斷及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2003－06～2009－12山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院和長治市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科收治的有完整臨床資料的原發(fā)性喉鱗狀細胞癌手術切除標本存檔蠟塊40例(喉癌組)，其中10例保留有相鄰的安全緣以外的正常喉黏膜組織(對照組)。40例患者中，男31例，女9例，年齡43－76歲，平均(57.6 ±6.2)歲。按國際抗癌聯(lián)合會(UICC)2002年TNM分期方案進行分期，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期12例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例;聲門上型癌24例，聲門型11例，聲門下型5例;高分化鱗癌28例，中分化鱗癌9例，低分化鱗癌3例;經病理證實有淋巴結轉移7例，無淋巴結轉移33例。所有病例術前均未行放、化療，病理診斷均為喉鱗狀細胞癌。

1.2 試劑與方法 Omi/HtrA2羊抗人單克隆抗體購自Santa-Cruz公司，caspase-7鼠抗人單克隆抗體購自Lab Vision公司，二步法免疫組化檢測試劑盒PV-6000購自北京中杉金橋生物技術有限公司。所有標本均經中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做4 μm厚連續(xù)切片備用。采用免疫組織化學技術二步法檢測Omi/HtrA2和caspase-7表達，按照免疫組織化學試劑盒說明書進行操作。

1.3 結果判斷 Omi/HtrA2、caspase-7蛋白陽性表達主要定位于細胞質，呈棕黃色。陰性對照以PBS液代替一抗，陽性對照為已知陽性切片。所有切片采用雙盲法閱片，隨機觀察10個100倍視野并計數(shù)，每個視野至少計數(shù)100個細胞，取其平均值作為該病例的細胞陽性數(shù)，并據此對染色結果分級，陽性細胞數(shù)＜25%為陰性(－)，陽性細胞數(shù)25%－50%為陽性(+)，陽性細胞數(shù)＞50%為強陽性(++)。采用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)(四川川大智勝公司)對染色結果進行定量分析，在100倍視野下每例標本選取5個陽性顆粒清晰，無非特異染色的視野，測定其目標平均灰度(G0)，視場平均灰度(GV)，面積密度(area ratio，AAR，即目標面積與視場面積的比值)按以下公式計算陽性單位(positive unit，PU)，取平均值。

2 結果

2.1 Omi/HtrA2和caspase-7的表達 Omi/HtrA2、caspase-7陽性表達均主要位于細胞質，呈棕黃色。Omi/HtrA2在喉鱗癌組織和正常喉黏膜組織中表達(圖1)的陽性率分別為:72.5%(29/40)和20.0%(2/10)，平均陽性單位分別為 26.952±7.145 和10.395 ±6.978，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.715，P＜0.05)。caspase-7 在喉鱗癌組織和正常喉黏膜組織中表達(圖2)的陽性率分別為:67.5%(27/40)、30.0%(3/10)，平均陽性單位分別為 29.365 ±8.152和 9.362 ±4.234，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.891，P＜0.05)。喉鱗癌組織中Omi/HtrA2和caspase-7表達具有相關性(r=0.332，P＜0.05)。

圖1 喉癌組織中Omi/HtrA2蛋白表達(DAB，×400)Fig 1 Expression of Omi/HtrA2 protein in laryngeal squamous cell carcinoma(DAB，×400)

圖2 喉癌組織中caspase-7蛋白表達(DAB，×400)Fig 2 Expression of Omi/HtrA2 protein in laryngeal squamous cell carcinoma(DAB，×400)

2.2 Omi/HtrA2和caspase-7表達與喉鱗癌臨床病理學特征之間的關系 喉鱗癌組織中Omi/HtrA2和caspase-7表達與年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期有無淋巴轉移無相關;與癌組織病理學分級有關，見表1。

3 討論

Omi/HtrA2是一種重要的促凋亡蛋白，是一種寡聚絲氨酸蛋白酶，由458個氨基酸組成，分子量為51 kD，編碼基因位于染色體2q13(或2p12)。Omi/HtrA2作為新近發(fā)現(xiàn)的促凋亡因子，對多種腫瘤細胞具有促凋亡效應［1，2］。Omi/HtrA2 以三聚體的形式存在，Omi/HtrA2分子結構中含有氨基末端的Reaper樣基序，絲氨酸蛋白酶功能區(qū)和C末端的PDZ結構域，此外，Omi/HtrA2還具有一個胰蛋白酶樣催化結構域和線粒體定向序列［3－5］。Omi/HtrA2通過兩種方式促進凋亡的發(fā)生:①結合X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)，通過caspase依賴的方式促凋亡;②憑借其絲氨酸蛋白酶活性以多條途徑促凋亡。近來的研究發(fā)現(xiàn)Omi/HtrA2在胃癌和卵巢癌中高表達［6，7］，本研究發(fā)現(xiàn) Omi/HtrA2 在喉鱗癌組織中高表達，在正常黏膜組織中弱表達，二者表達差異具有統(tǒng)計學意義，提示Omi/HtrA2在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用。本研究中，在喉癌不同病理分級中，G1與G2+G3級比較，Omi/HtrA2表達差異有統(tǒng)計學意義，提示Omi/HtrA2過表達與喉癌的惡性程度有關，Omi/HtrA2可能參與了腫瘤的分化，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究還顯示，Omi/HtrA2陽性表達與喉癌患者的年齡、性別、臨床分型(腫瘤部位)、臨床TNM分期和淋巴結轉移均無相關性，提示Omi/HtrA2過表達只是喉癌發(fā)生、發(fā)展過程中一個較早期的重要分子事件。

caspase-7屬于半胱氨酸－天冬氨酸蛋白酶家族成員，是 caspase家族中重要成員，caspase-7是caspase級聯(lián)反應中的下游分子之一，由303個氨基酸組成，分子量為35 kD，分布在胞質內和近膜結構上，是凋亡的最終效應分子之一。在細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中，目前發(fā)現(xiàn)信號轉導通路有三條:一為caspase的細胞外通路(細胞膜途徑);二為caspase的細胞內通路(線粒體途徑);三為caspase的內質網通路。caspase-7是重要的效應蛋白，在三條凋亡途徑中都起作用。本研究發(fā)現(xiàn)caspase-7在喉鱗癌組織中高表達，在正常黏膜組織中弱表達，二者表達差異具有統(tǒng)計學意義，表明caspase-7可能與喉癌的發(fā)生、發(fā)展有關。caspase-7在喉癌中的表達與喉癌患者的年齡、性別、臨床分型(腫瘤部位)、臨床TNM分期和淋巴結轉移均無關，僅與組織分化有關，提示caspase-7可能通過調控喉癌細胞的凋亡影響喉癌的惡性程度。

表1 Omi/HtrA2和caspase-7表達與喉鱗癌臨床病理學特征的關系Tab 1 Relationship between expression of Omi/HtrA2，caspase-7 and clinical pathological features in larynx cancer tissues

本研究對Omi/HtrA2和caspase-7在喉鱗癌組織中表達的相關性進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)二者存在相關性，提示Omi/HtrA2可能通過多種作用方式裂解XIAP，從而解除了 XIAP對caspase-7的抑制作用，引起caspase-7在喉鱗癌組織中高表達。喉鱗癌組織中凋亡機制非常復雜，細胞凋亡減少是各種促凋亡因素和抑制凋亡因素共同作用的結果，也是導致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，這也提示我們利用各種方法促進腫瘤細胞的凋亡可以達到治療腫瘤的目的，利用Omi/HtrA2抑制凋亡抑制蛋白(IAPs)的作用來促進腫瘤細胞凋亡可為惡性腫瘤的治療提供新思路。

［1］ Verhagen AM，Silke J，Ekert PG，et al.HtrA2 promotes cell death through its serine protease activity and its ability to antagonize inhibitor of apoptosis proteins［J］.J Biol Chem，2002，277(1):445－454.

［2］ Hegde R，Srinivasula SM，Zhang Z，et al.Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction［J］.J Biol Chem，2002，277(1):432－438.

［3］ Nam MK，Seong YM，Park HJ，et al.The homotrimeric structure of HtrA2 is indispensable for executing its serine protease activity［J］.Exp Mol Med，2006，38(1):36－43.

［4］ Garcia-Ruiz C，Mari M，Colell A，et al.Mitochondrial cholesterol in health and disease［J］.Histol Histopathol，2009，24，24(1):117－132.

［5］ Martins LM，Turk BE，Cowling V，et al.Binding specificity and regulation of the serine protease and PDZ domains of HtrA2/Omi［J］.J Biol Chem，2003，278(49):49417－49427.

［6］ Lee SH，Lee JW，Kim HS，et al.Immunohistochemical analysis of Omi/HtrA2 expression in stomach cancer［J］.APMIS，2003，111(5):586－590.

［7］ Yang X，Xing H，Gao Q，et al.Regulation of HtrA2/Omi by X-linked inhibitor of apoptosis protein in chemoresistance in human ovarian cancer cells［J］.Gynecol Oncol，2005，97(2):413－421.