黑色素細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程化皮膚

宋可新，喬 群，劉大慶，王曉軍，趙 茹，劉志飛，裴雪濤

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院整形外科，北京100032

2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室，北京100850

皮膚缺損創(chuàng)面修復(fù)是整形外科臨床常見問題之一，組織工程皮膚的研發(fā)和應(yīng)用為皮膚缺損修復(fù)提供了新的治療策略。目前已有組織工程化的真皮和全層皮膚等產(chǎn)品上市，然而這些人工皮膚僅發(fā)揮遮蓋創(chuàng)面和加速愈合的功能，無法起到色素調(diào)節(jié)、毛發(fā)生長、分泌汗液等重要功能。正常皮膚中含有黑色素細(xì)胞，它對(duì)于調(diào)節(jié)皮膚色澤以及防止紫外線照射引起細(xì)胞損傷起著重要作用。本研究在前期以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程全層皮膚的研究基礎(chǔ)［1］上，將黑色素細(xì)胞與BMSCs以適合的比例混合培養(yǎng)，并利用I型膠原膜為支架材料，構(gòu)建含有色素細(xì)胞的組織工程化皮膚，以期為研發(fā)具有色素功能的組織工程化皮膚提供理論依據(jù)。

材料和方法

人黑色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定無菌條件下取包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織 (標(biāo)本由北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科激光中心提供，經(jīng)患者知情同意，由北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過)，置于培養(yǎng)皿中，加入5 ml 2.5 g/L dispase酶中，4℃過夜后，仔細(xì)分離表皮、真皮層，剪碎表皮，加入5～10 ml 0.25%胰酶/0.02%EDTA，常溫下用吸管反復(fù)吹打5 min;加入含有10%胎牛血清的L-DMEM，1200 r/min(r=17.01 cm)離心5 min，棄上清;PBS重懸，過200目篩網(wǎng)，1200 r/min(r=17.01 cm)離心5 min，棄上清;黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸，以5×105個(gè)細(xì)胞/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng);48～72 h后換液，加入黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基 (HMGS-2+M254培養(yǎng)基，美國Cascade公司)繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合時(shí)，采用0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化傳代。通過S-100蛋白的免疫組織化學(xué)染色及透射電鏡觀察對(duì)獲取的黑色素細(xì)胞進(jìn)行鑒定［2］。

BMSCs的分離、純化、擴(kuò)增與鑒定無菌條件下直接抽取健康志愿者骨髓 (捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書，并經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn))，BMSCs的分離、純化及擴(kuò)增參照侯玲玲等［3］的方法進(jìn)行。采用S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。

混和細(xì)胞培養(yǎng)基的篩選

不同培養(yǎng)基對(duì)黑色素細(xì)胞增殖的影響:取長勢(shì)良好的第3代黑色素細(xì)胞，0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化，1200 r/min(r=17.01 cm)離心5 min;PBS洗滌1次，1200 r/min(r=17.01 cm)離心5 min。分別用3組不同的培養(yǎng)基 (黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基、BMSCs完全培養(yǎng)基、表皮細(xì)胞培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞沉淀、計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104個(gè)/ml。以每孔1.5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每板接種3組，每組8孔，并另設(shè)1個(gè)對(duì)照孔;分別用3組不同培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別于接種后第1～4天的相同時(shí)間取出1個(gè)孔板，觀察細(xì)胞形態(tài)，換液后在每孔內(nèi)加入10 μl細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)試劑，將孔板放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h。取出孔板，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定吸光度，參比波長為655 nm;計(jì)算平均吸光度值及標(biāo)準(zhǔn)差，繪制細(xì)胞增殖曲線。

不同培養(yǎng)基對(duì)BMSCs增殖的影響:取長勢(shì)良好的第3代BMSCs，0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，1200 r/min(r=17.01 cm)離心5 min，按照以上方法繪制細(xì)胞增殖曲線。

體外構(gòu)建組織工程化皮膚，修復(fù)裸鼠創(chuàng)面

膠原膜的制備:取新鮮牛肌腱，按He等［1］的方法制備膠原膜。

黑色素細(xì)胞、BMSCs與膠原膜復(fù)合體外構(gòu)建組織工程化皮膚:(1)將制備的膠原膜剪成直徑2 cm大小，置于24孔板中進(jìn)行鈷源照射滅菌。(2)用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液 (完全培養(yǎng)液)浸泡72 h，每天換液，并測(cè)量pH值至7.2～7.4為止。(3)消化第3代BMSCs，用BMSCs完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液;取200 μl該濃度細(xì)胞懸液緩慢加到無菌膠原膜表面，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育4 h;待細(xì)胞緊密貼附在膠原膜表面，再加入1 ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜。(4)消化第3代黑色素細(xì)胞，用黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，按每5×106個(gè)細(xì)胞加入終濃度為5 μg/ml的DAPI，37℃孵育30 min，PBS反復(fù)洗滌，以去除未結(jié)合的DAPI熒光染料，即對(duì)黑色素細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記;吸出前一天24孔板中的BMSCs完全培養(yǎng)基，取200 μl該濃度細(xì)胞懸液緩慢加到無菌膠原膜表面，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育4 h;待細(xì)胞緊密貼附在膠原膜表面，再加入1 ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

黑色素細(xì)胞、BMSCs在膠原膜上生長情況的電鏡觀察:用單純黑色素細(xì)胞及BMSCs構(gòu)建好的組織工程化皮膚在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)2 d后，用3%戊二醛固定后，經(jīng)過脫水、環(huán)氧樹脂浸透及包埋，進(jìn)行修塊、定位，制備成超薄切片后行掃描電鏡觀察。

組織工程化皮膚的免疫組織化學(xué)染色:取用單純黑色素細(xì)胞及BMSCs構(gòu)建好的組織工程化皮膚，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)2 d后，切成0.5 mm×0.5 mm大小，OCT包埋劑浸沒組織，置于－23℃ 恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)，制成10 μm冰凍切片，然后進(jìn)行S-100蛋白的免疫組織化學(xué)染色。

動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn):將27只雄性CD1裸鼠 ［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司、體重 (22±2)g］用3.5%水合氯醛麻醉后，于背部切取全層皮膚形成直徑1.5 cm的圓形皮膚缺損創(chuàng)面，然后隨機(jī)分為3組:(1)實(shí)驗(yàn)組:采用黑色素細(xì)胞和BMSCs混和與膠原膜復(fù)合構(gòu)建的組織工程化皮膚修復(fù)皮膚缺損;(2)陽性對(duì)照組:單純采用黑色素細(xì)胞與膠原膜復(fù)合構(gòu)建的組織工程化皮膚修復(fù)皮膚缺損;(3)陰性對(duì)照組:單純采用BMSCs與膠原膜復(fù)合構(gòu)建的組織工程化皮膚修復(fù)皮膚缺損。術(shù)后外敷無菌紗布，用打包法進(jìn)行縫合固定后單籠飼養(yǎng)。分別在創(chuàng)面修復(fù)術(shù)后第1、2、3周，每組隨機(jī)抽取3只裸鼠切取創(chuàng)面中央直徑0.5 cm范圍的皮膚，分別進(jìn)行透射電鏡、免疫熒光、組織學(xué)檢測(cè)。

結(jié) 果

人黑色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定結(jié)果原代細(xì)胞接種4 h后，可見細(xì)胞貼壁伸展，大部分細(xì)胞呈短梭型或卵圓形，第3天可見部分細(xì)胞呈典型的樹突狀，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長突起更加明顯，并由多樹突狀向兩極細(xì)長的長梭形發(fā)展，此時(shí)細(xì)胞密集，類似雪旺氏細(xì)胞 (圖1A)。S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，人黑色素細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞漿均呈棕褐色，細(xì)胞核染色更為明顯 (圖1B)。透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)除有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體等細(xì)胞器外，尚有特征性的黑色素小體 (圖1C)。

BMSCs的S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見BMSCs的胞漿和胞核無明顯棕褐色染色，與陰性對(duì)照細(xì)胞 (成纖維細(xì)胞)和陰性對(duì)照試劑 (PBS)的結(jié)果相一致，是陰性結(jié)果，而與陽性對(duì)照細(xì)胞(黑色素細(xì)胞)的陽性結(jié)果明顯不同 (圖2)。

體外構(gòu)建組織工程化皮膚的情況細(xì)胞懸液滴到膠原膜表面后即刻觀察，可見圓球狀細(xì)胞與膠原膜表面纖維貼附或滲透到膠原膜空隙中 (圖3)。掃描電鏡可見在膠原膜上種植的黑色素細(xì)胞緊密貼附于膠原膜表面，充分伸展，呈兩極細(xì)尖的長梭形生長，生長狀態(tài)良好，BMSCs也呈長梭形生長 (圖4A、B)。S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色可見單純膠原膜上沒有細(xì)胞生長，沒有染色，只能看到屈曲纏繞的膠原纖維;單純黑色素細(xì)胞與膠原膜復(fù)合構(gòu)成的組織工程化皮膚則可見膠原纖維上有大量的細(xì)胞吸附，并且大部分細(xì)胞呈棕褐色染色;黑色素細(xì)胞和BMSCs混和與膠原膜復(fù)合構(gòu)成的組織工程化皮膚可見細(xì)胞密集分布，只有少部分細(xì)胞呈棕褐色染色，大部分細(xì)胞未被染色 (圖4C、D)

創(chuàng)面修復(fù)后的組織學(xué)觀察

大體標(biāo)本觀察:術(shù)后第1周，3組裸鼠皮膚創(chuàng)面均未愈合，為肉芽創(chuàng)面，結(jié)有少許血痂。術(shù)后第2周，各組創(chuàng)面均開始愈合，陽性對(duì)照組創(chuàng)面相對(duì)較大，結(jié)的痂皮較厚;實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面面積最小，中心有少許薄層血痂，顏色比周圍正常皮膚略暗;陰性對(duì)照組創(chuàng)面愈合程度居中，結(jié)有少許血痂。術(shù)后第3周，各組創(chuàng)面均完全愈合，陽性對(duì)照組仍有少量薄層血痂;實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面形成完整的皮膚，顏色比周圍略暗;陰性對(duì)照組亦形成完整皮膚，表皮較薄，顏色略紅 (圖5)。

DAPI標(biāo)記黑色素細(xì)胞的示蹤觀察:術(shù)后第1周，實(shí)驗(yàn)組裸鼠背部術(shù)區(qū)皮膚做冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察，可見帶有DAPI標(biāo)記的細(xì)胞分布于表皮深層，同時(shí)也可以看到膠原膜材料自發(fā)的熒光;術(shù)后第2周，仍可見帶有DAPI標(biāo)記的細(xì)胞分布于表皮深層 (圖6)。

HE染色:在修復(fù)創(chuàng)面術(shù)后第3周，可見各組均形成完整的表皮結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組相比，表皮增厚，表皮層結(jié)構(gòu)清楚，可見分化明顯的基底層、棘層、顆粒層、角質(zhì)層，基底層細(xì)胞排列緊密;真皮層可見瘢痕組織形成，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞減少，成纖維細(xì)胞增多，膠原纖維增多且排列有序。實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照兩組無明顯差異;人正常皮膚表皮更厚，各層細(xì)胞排列更有序，并且釘突明顯，而裸鼠自身皮膚表皮層較薄，無明顯的各層細(xì)胞排列 (圖7)。

S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色:陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組表皮層下有棕褐色帶狀分布的細(xì)胞，與人正常皮膚組的結(jié)果相一致;而以PBS代替一抗的表皮下均無棕褐色帶狀細(xì)胞分布;陰性對(duì)照組與裸鼠正常皮膚，無論是S-100蛋白還是PBS代替一抗均無棕褐色帶狀細(xì)胞分布，為陰性結(jié)果 (圖8)。

透射電鏡觀察結(jié)果:組織工程化皮膚組可見表皮細(xì)胞分層排列良好，細(xì)胞質(zhì)中存在大量張力細(xì)絲，細(xì)胞間有明顯的橋粒連接;表皮基底層細(xì)胞、黑色素細(xì)胞與基底膜存在半橋粒連接，黑色素細(xì)胞中可以觀察到黑色素小體;真皮層可見較多成纖維細(xì)胞，其細(xì)胞周圍可見有大量的膠原形成和沉積 (圖9)。

討 論

皮膚是人體最大器官，具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，并且含有毛囊、汗腺、皮脂腺等附屬器官，發(fā)揮著重要的屏障保護(hù)、調(diào)節(jié)體溫、生發(fā)等生理作用，目前已經(jīng)上市的各種組織工程皮膚產(chǎn)品還只是起到覆蓋皮膚缺損創(chuàng)面和加速創(chuàng)面愈合的功效，多數(shù)只是暫時(shí)的皮膚組織替代物;不僅其所具有的外形、韌性和機(jī)械性能等明顯低于天然皮膚，沒有正常皮膚的毛囊、血管、汗腺及黑色素細(xì)胞和朗格罕氏細(xì)胞等成分，而且在功能上，如皮膚的屏障功能、免疫功能、物質(zhì)交換及能量交換等方面仍距正常皮膚有較大差距。

在前期研究工作中，筆者以自體BMSCs為種子細(xì)胞，利用BMSCs良好的增殖能力和多向誘導(dǎo)分化潛能，并且以具有良好生物學(xué)相容性和理化性狀的牛源性I型膠原膜為支架材料，在體外成功構(gòu)建了基于自體成體干細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程化皮膚，分別移植入裸鼠和小型豬皮膚缺損處后，一方面有效封閉創(chuàng)面，加速了皮膚缺損處的創(chuàng)面愈合，另一方面，可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)形成了具有表皮和真皮不同組織層次的接近正常皮膚的結(jié)構(gòu)，為構(gòu)建具有完美生物學(xué)功能的組織工程化皮膚奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［1］。在此基礎(chǔ)上，本研究將分離純化的黑色素細(xì)胞作為種子細(xì)胞，通過在體外以一定的比例和BMSCs混合培養(yǎng)，一同接種到I型膠原膜上構(gòu)建含有色素細(xì)胞的組織工程化皮膚。S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，以人上瞼皮膚組織作為陽性細(xì)胞對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)其在表皮下呈棕褐色帶狀分布;以裸鼠表皮為陰性對(duì)照，則未發(fā)現(xiàn)表皮有這種棕褐色帶狀分布的細(xì)胞;而本研究構(gòu)建的組織工程化皮膚中人黑色素細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長分布情況與人上瞼皮膚的黑色素細(xì)胞類似，也是在表皮下呈棕褐色帶狀分布，說明筆者構(gòu)建的組織工程化皮膚中的黑色素細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)已經(jīng)成活，而且其生長分布也是正常的。DAPI的熒光標(biāo)記示蹤結(jié)果證實(shí)，裸鼠體內(nèi)的黑色素細(xì)胞來源于人。

圖9 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第3周創(chuàng)面皮膚透射電鏡觀察Fig 9 Observation of the skin of experimental group under transmission electron microscope 3 weeks after implantation

人正常皮膚組織在電鏡下觀察，黑色素細(xì)胞呈圓形或卵圓形，細(xì)胞基底面借半橋粒連于基板，頂部長而不規(guī)則的突起伸入基底層和棘層細(xì)胞之間，但不與之形成橋粒。胞核小，常染色質(zhì)豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，核蛋白豐富，線粒體粗大，微管、中間絲和微絲延伸入樹狀突起中。該細(xì)胞最大特征是胞質(zhì)內(nèi)含有很多黑色素小體，它是黑色素在細(xì)胞內(nèi)存在的形態(tài)，呈圓形或卵圓形，含酪氨酸酶，參與黑色素的形成，也是黑色素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞輸送黑色素的供體。本研究構(gòu)建的組織工程化皮膚中的黑色素細(xì)胞中可以觀察到上述結(jié)構(gòu)，能夠看到黑色素小體，且黑色素細(xì)胞通過半橋粒與基底膜相連接，提示本研究構(gòu)建的組織工程化皮膚參與了創(chuàng)面的皮膚修復(fù)過程，生長良好，并且形成了具有功能性的結(jié)構(gòu)。

BMSCs是多能成體干細(xì)胞，能夠向不同的中胚層細(xì)胞分化，包括成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。雖然有爭(zhēng)論，但也有研究表明其可以跨胚層分化，向非中胚層起源的肝細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞或是各種上皮細(xì)胞分化［4-7］。但是目前認(rèn)為，BMSCs在修復(fù)組織的過程中，其改變組織微環(huán)境的能力可能比分化轉(zhuǎn)移的能力發(fā)揮更大的作用［8］。BMSCs可以分泌許多細(xì)胞因子，產(chǎn)生很多機(jī)制，包括促進(jìn)含有的內(nèi)源性干細(xì)胞樣前體細(xì)胞的增生和分化［9-10］，加強(qiáng)受損細(xì)胞的再生，誘導(dǎo)血管再生［11-12］，抑止炎癥和免疫反應(yīng)［13］，減輕細(xì)胞凋亡［14］，轉(zhuǎn)移線粒體［15］等。故在本研究并未著重追蹤BMSCs的分布和分化情況，而主要觀察其在組織中的實(shí)際修復(fù)功能。HE染色的組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陰性細(xì)胞對(duì)照組表皮層更厚，表皮細(xì)胞排列更有序，說明了其在組織修復(fù)過程中的良好作用。由于本研究的重點(diǎn)在于黑色素細(xì)胞的檢測(cè)，同時(shí)也因?yàn)楣P者在前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)觀察其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［1］，所以在本研究中未對(duì)創(chuàng)面修復(fù)的實(shí)際效果做統(tǒng)計(jì)學(xué)觀察和處理。

綜上，本研究結(jié)果顯示，用黑色素細(xì)胞和BMSCs混和與膠原膜構(gòu)建的組織工程化皮膚在體內(nèi)可以有很好的修復(fù)效果。在實(shí)際的組織修復(fù)中，黑色素細(xì)胞和BMSCs之間并沒有抑制作用，二者可以很好的共存而共同發(fā)揮各自的作用。

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圖1 人黑色素細(xì)胞的鑒定Fig 1 Identification of human melanocytes

圖2 BMSCs S-100蛋白的免疫組織化學(xué)染色 (×100)Fig 2 S-100 immunohistochemical stainning of BMSCs(×100)

圖3 黑色素細(xì)胞及BMSCs與膠原膜復(fù)合后的大體觀察Fig 3 Gross observation of melanocytes and BMSCs on the collagen membrane

圖4 黑色素細(xì)胞及BMSCs在膠原膜上生長觀察Fig 4 Morphological observation of melanocytes and BMSCs on the collagen membrane

圖5 裸鼠創(chuàng)面愈合的大體觀察Fig 5 Gross observation of the nude mouse wound healing

圖6 DAPI標(biāo)記黑色素細(xì)胞的示蹤觀察 (×40)Fig 6 Tracing of DAPI-labeled melanocytes(×40)

圖7 組織工程化皮膚修復(fù)皮膚缺損創(chuàng)面的HE染色 (×100)Fig 7 HE staining of the wound repaired by the tissue-engineered skin(×100)

圖8 組織工程化皮膚修復(fù)皮膚創(chuàng)面的S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色 (×100)Fig 8 S-100 immunohistochemical staining of the wound repaired by the tissue-engineered skin(×100)