趙紅蕾 曹 宏 孫月芳 田曉豐 (吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 30062)

轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段原核表達載體的構(gòu)建及表達

趙紅蕾 曹 宏1孫月芳1田曉豐1(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062)

目的 從人正常組織中克隆人轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段，構(gòu)建其原核表達載體，并在大腸桿菌中進行表達，純化獲得蛋白，用于下一步探討ZHX2基因的功能。方法 根據(jù)GenBank中ZHX2功能片段已知序列設(shè)計引物，從正常人組織中通過RT-PCR方法擴增ZHX2基因功能片段，克隆到原核表達載體pET28a(+)中，轉(zhuǎn)化Ecoli.BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達，采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白。結(jié)果 測序結(jié)果顯示克隆的ZHX2基因序列正確，SDS-PAGE鑒定表達產(chǎn)物分子量正確，Western-blot鑒定結(jié)果顯示表達產(chǎn)物為人ZHX2功能片段特異性蛋白。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了含有ZHX2功能片段的原核融合表達載體，并實現(xiàn)了ZHX2功能片段的表達，獲得了純化的蛋白，為進一步研究ZHX2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

ZHX2基因;轉(zhuǎn)錄抑制因子;原核表達

ZHX(zinc-fingers and homeoboxes，ZHX)蛋白家族包括ZHX1、ZHX2和ZHX3，在人體組織中廣泛存在，在組織中作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮重要的病理生理功能〔1，2〕。ZHX2是ZHX蛋白家族成員之一，是2003年新克隆的轉(zhuǎn)錄抑制因子，位于染色體8q24.13，其編碼的蛋白含837個氨基酸殘基，定位于細胞核內(nèi)〔3〕。近年來的研究結(jié)果顯示，ZHX2參與正常肝細胞中肝癌標志物的轉(zhuǎn)錄抑制，提示ZHX2的表達缺失可能是肝細胞癌發(fā)生的關(guān)鍵因素〔4〕。本研究設(shè)計構(gòu)建人ZHX2基因功能片段的原核表達載體，為進一步確定ZHX2蛋白發(fā)揮有效生物學(xué)作用的最小功能片段奠定基礎(chǔ)，同時也為進一步研究ZHX2基因的功能提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)pLysS由本室保存，pMD-18T載體購自Takara公司，原核表達載體pET28a(+)由本室保存。

1.2 試劑 總RNA提取試劑盒Trizol reagent和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermoscript TM RT-PCR SYSTEM為GIBCo BRL公司產(chǎn)品;T4 DNA ligase為Promega公司產(chǎn)品;DL 2000 DNA Marker、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、IPTG均購自TaKaRa公司;低分子量蛋白 Marker(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4 kU)購自上海生物化學(xué)研究所，窄譜預(yù)染蛋白質(zhì)Marker(71、50、35、25、16、8 和 2 kU)購自賽百盛基因技術(shù)有限公司;ZHX2單克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology公司;HRP兔抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中人ZHX2 cDNA序列(gi：63079684)使用Prim 5軟件在ZHX2基因的上下游設(shè)計F1和R1兩條引物，上游引物F1：5'GAA TTC GTG ACA GAC ACA GCT GAG ATC C 3';下游引物 R1：5'CTC GAG GCC CCT TTG ACA CCG ATA T 3'，分別含EcoR I和Sal I酶切位點，理論擴增目的片段為837 bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 人ZHX2基因功能片段的克隆及測序 用Trizol reagent提取人正常肝組織總RNA，具體操作按文獻〔5〕方法進行，沉淀置于室溫干燥后加入30 μl水(含RNase inhibitor l μl)溶解，取3～5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢查。立即進行逆轉(zhuǎn)錄或加入2倍體積的乙醇-80℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)嚴格按照試劑盒操作說明進行。取RNA 1 μg參照Quant script RT Kit試劑盒說明操作，取Quant Reverse Transcrplase 1 μl以及10×RT mix、dNTP 混合液(2.5 mmol/L)、Random(10 μmol/L) 各2 μl，加 DEPC 水定容至20 μl，37℃孵育60 min。所得 cDNA 用DEPC水稀釋至50 μl置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增按50 μl體系進行，取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以引物F1/R1對RT產(chǎn)物進行擴增，94℃，2 min預(yù)變性;循環(huán)參數(shù)為：94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 80 s，35個循環(huán);然后72℃延伸7 min。擴增結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠。用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，并與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，PCR及酶切鑒定陽性克隆，初步鑒定成功的pMD-18T-ZHX2質(zhì)粒送大連寶生物公司測序。

1.5 人ZHX2基因功能片段原核表達載體的構(gòu)建 以EcoR I和Sal I對pMD-18T-ZHX2質(zhì)粒和pET28a(+)載體雙酶切，回收后連接、轉(zhuǎn)換大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行PCR和酶切鑒定。鑒定正確質(zhì)粒命名為pET28a-ZHX2。

1.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定 將含有表達載體pET28a-ZHX2的宿主菌接種含卡那霉素(30 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖震培養(yǎng)至 OD600 0.4～0.6，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3～5 h，離心收集菌體，加入原培養(yǎng)液1/10體積的0.1 mol/L PBS重懸菌體，-20℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)液在4℃、5 500 r/min離心20 min，收集細胞沉淀物，沉淀物經(jīng)超聲裂解后用相同體積的PBS(pH7.0)重懸，沉淀和上清通過12 000 r/min離心20 min進行分離。進行SDS-PAGE檢測分析，產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA樹脂純化。把可溶上清液轉(zhuǎn)移到純化柱上，然后用5倍體積的PBS(pH7.0)溶液沖洗純化柱。目的蛋白分別用含有10、20、50、100 mmol/L咪唑的 PBS(pH7.0)進行梯度洗脫。洗脫液經(jīng)透析、濃縮、過濾除菌，Bradford法測定蛋白濃度后-70℃保存。

SDS-PAGE按文獻〔5〕方法進行：灌制12%聚丙烯酰胺分離膠和5%的濃縮膠，取收集的上清20 μl和少量上樣緩沖液混勻后上樣，0.25%考馬斯亮藍R-250染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析表達產(chǎn)物。Western印跡檢測按文獻〔6〕所述方法進行，轉(zhuǎn)膜后在含有5%脫脂牛奶封閉液中封閉1 h，之后膜在1∶1 000的ZHX2單克隆抗體中4℃雜交過夜，第二天用PBS洗3次之后用1∶2 000的HRP標記的兔抗小鼠IgG二抗雜交1 h，PBS洗3次，在ECL儀器上用ECL底物發(fā)光液顯影。

2 結(jié)果

2.1 ZHX2的克隆測序結(jié)果 ZHX2基因功能片段RT-PCR擴增后得到特異性的目的片段，結(jié)果如圖1所示，用引物F1/R1進行PCR，得到大小為837 bp的片段，擴增結(jié)果與預(yù)期相符。經(jīng)測序，與GenBank序列信息一致。

2.2 ZHX2原核表達載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果 菌落PCR結(jié)果表明，插入片段與目的片段大小一致。pET28a-ZHX2重組質(zhì)粒用EcoR I和Sal I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明酶切后的片段大小約3 000 bp和837 bp，說明外源片段已插入。見圖1。

2.3 ZHX2蛋白的誘導(dǎo)表達和鑒定結(jié)果 pET28a(+)-ZHX2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達，在30℃，0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，誘導(dǎo)的表達產(chǎn)物經(jīng)純化后，取上清液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示有融合蛋白表達，分子質(zhì)量約為31 kD，與預(yù)期相符合。Western印跡結(jié)果顯示，純化后的表達蛋白與商品化的ZHX2單克隆抗體在32 kD處出現(xiàn)特異性條帶。見圖1。

圖1 ZHX2克隆、pET28a-ZHX2重組質(zhì)粒及ZHX2蛋白誘導(dǎo)表達和蛋白結(jié)果

3 討論

ZHX 蛋白家族分子結(jié)構(gòu)中均包括兩個鋅指結(jié)構(gòu)(zinc-finger motifs)和五個同源結(jié)構(gòu)域(homeo domains，HDs)。三種蛋白自身可組成同源二聚體，兩種蛋白相互之間也可形成異源二聚體，ZHX2在肝、腎、脾臟等不同組織中都有很廣泛的表達〔7〕，近期研究顯示ZHX2可能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展：ZHX2不僅抑制肝癌細胞AFP的表達，而且在腎病綜合征中參與腎小球內(nèi)足細胞的調(diào)控〔8〕;另有研究顯示，ZHX2表達與多發(fā)性骨髓瘤惡性程度及患者愈后呈負相關(guān)〔9〕。上述研究提示ZHX2可能是一個重要的抑癌基因。

ZHX2和ZHX1具有較高的同源性，在編碼序列和氨基酸序列上的同源性分別為45.5%和41.9%。ZHX2主要定位在核內(nèi)，有兩個核定位信號，位于第317位氨基酸和第446位氨基酸之間。ZHX2蛋白間可形成同源二聚體，也可以與同家族成員ZHX1或ZHX3形成異源二聚體，二聚體結(jié)合區(qū)位于HDI(第195位氨基酸和第358位氨基酸之間)。ZHX家族成員結(jié)構(gòu)相似，分子量大小相近。因此，抗原設(shè)計時應(yīng)盡量避開共同或相似結(jié)構(gòu)域。Yamada〔4〕報道，ZHX2蛋白263AA～497AA之間有一個脯氨酸富集區(qū)，是不同于ZHX1和ZHX3的一個特殊結(jié)構(gòu)域，通過BLAST對比分析ZHX家族氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，ZHX2在263AA～497AA區(qū)域內(nèi)較其他成員同源性低。王金金等〔10〕對人的ZHX2基因進行了真核表達，通過對表達結(jié)果的對比分析，將ZHX2的最小抑制區(qū)域縮小到242AA～501AA區(qū)域內(nèi)。本研究根據(jù)上述研究結(jié)果，針對其設(shè)計的抗原片段更易產(chǎn)出特異性強的抗體，原核細胞中表達蛋白純化后免疫動物獲得血清，Western印跡結(jié)果顯示制備的抗體具有良好的特異性。

ZHX2蛋白全長837個氨基酸，含有多個功能域，但并非所有功能域都具有抑制功能。Kawata等〔3〕構(gòu)建了ZHX2系列缺失表達載體，經(jīng)共轉(zhuǎn)染實驗和報告基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZHX2抑制cdc25基因啟動子的最小抑制區(qū)域在氨基酸序列263～446范圍內(nèi)，這個區(qū)域包含了整個HD1區(qū)和脯氨酸富含區(qū)，但該功能域是否同樣是ZHX2抑制AFP、參與HCC及多種疾病發(fā)生的最小功能域，迄今尚不清楚。本研究根據(jù)ZHX2的編碼序列，成功構(gòu)建了人ZHX2基因功能片段的原核表達載體pET28a-ZHX2，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下實現(xiàn)了目的蛋白的可溶性表達，Western印跡結(jié)果表明，本實驗獲得的表達蛋白為ZHX2基因特異性蛋白，為基因工程生產(chǎn)和改造ZHX2創(chuàng)造了條件，也為進一步闡明ZHX2基因的結(jié)構(gòu)與功能及其在疾病發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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4 Yamada K，Ogata-Kawata H，Matsuura K，et al.ZHX2 and ZHX3 repress cancer markers in normal hepatocytes〔J〕.Front Biosci，2009;14(1)：3724-32.

5 薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T，著.金冬雁，黎孟楓，侯云德，譯.分子克隆實驗指南〔M〕.北京：科學(xué)出版社，2002：362-92.

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7 Perincheri S，Dingle RW，Peterson ML，et al.Hereditary persistence of alpha-protein and H19 expression in liver of BALB/cJ mice is due to a retrovirus insertion in the ZHX2 gene〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(2)：396-401.

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10 王金金，史 偉，祁建妮，等.轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段的克隆及表達〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2009;47(5)：1-4.

R996

A

1005-9202(2011)16-3115-03

1 吉林大學(xué)第二醫(yī)院普外科中心

田曉豐(1976-)，男，博士后，主治醫(yī)師，主要從事肝膽胰外科臨床及基礎(chǔ)研究。

趙紅蕾(1987-)，女，碩士，主要從事分子免疫學(xué)研究。

〔2011-02-15收稿 2011-05-07修回〕

(編輯 徐 杰)