張威威 秦公偉 程水源 許 鋒

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025) (陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000) (黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 黃岡 438000) (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

銀杏愈傷組織誘導(dǎo)初步研究

張威威 秦公偉 程水源 許 鋒

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025) (陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000) (黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 黃岡 438000) (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

以銀杏(Ginkgobiloba)的嫩葉為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，探討了6-BA、KT及NAA不同配比組合在愈傷組織誘導(dǎo)中的作用。結(jié)果表明，MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)的銀杏愈傷組織生長量多，呈淺黃綠色、顆?；黠@、排列疏松，效果較好。

銀杏(Ginkgobiloba)；培養(yǎng)基；愈傷組織

銀杏(Ginkgobiloba)是現(xiàn)有種子植物中最古老的孑遺植物，又稱“活化石”。銀杏壽命長，又名“公孫樹”。它原產(chǎn)中國，具有極高的經(jīng)濟、生態(tài)、觀賞和科研價值，尤其是銀杏體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)黃酮、帖內(nèi)酯的藥用價值[1]，已受到世界范圍內(nèi)研究者日益廣泛的關(guān)注。

通過組織培養(yǎng)獲取大量細(xì)胞，從中提取黃酮、銀杏帖內(nèi)酯等藥用成分，不僅可以人為控制培養(yǎng)條件，選擇優(yōu)良細(xì)胞系得到較高含量的代謝產(chǎn)物，還具有速度快，周期短，效率高等特點。上世紀(jì)30年代以來，國內(nèi)外學(xué)者先后開展了銀杏配子體、胚、葉片、莖段等外植體培養(yǎng)研究。各種外植體在一定條件下已誘導(dǎo)出愈傷組織，但有關(guān)影響銀杏愈傷組織培養(yǎng)因子研究報道較少[2，3]。本研究通過對培養(yǎng)基、激素種類和濃度等培養(yǎng)條件進行了初步探討，以期尋求一種適合銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的方法，為銀杏生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

銀杏葉采自長江大學(xué)銀杏科技園，銀杏品種為10年生家佛手，樹勢良好，生長正常。

1.2方法

(1)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 采用的培養(yǎng)基為：①MS+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L；②MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L；③MS+NAA 2 mg/L+6-BA 1 mg/L。

(2)愈傷組織誘導(dǎo) 將剛采集的銀杏嫩葉先用自來水沖洗干凈，經(jīng)蒸餾水漂洗，裝入廣口瓶放入超凈工作臺，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液滅菌約10 s，傾倒掉乙醇后，材料轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的升汞溶液中消毒8～10 min，完成后立即用無菌水沖洗3～4次[4,5]。夾取嫩葉，在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)無菌濾紙上，將材料切分成3～5 mm的小塊，分別接種在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上；每瓶接種4塊，每種培養(yǎng)基接種60瓶。

(3)培養(yǎng)條件 每天光照12 h左右，光照強度2 000 lx，溫度控制在(28±1)℃，相對濕度60%～75%。

(4)指標(biāo)計算方法 分別按下述公式計算成活率、污染率、死亡率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

成活率(%)=(未污染未壞死外植體數(shù)/接種外植體個數(shù))×100%；

污染率(%)=(污染外植體數(shù)/接種外植體個數(shù))×100%；

死亡率(%)=(壞死外植體數(shù)/接種外植體個數(shù))×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=(再生愈傷團數(shù)/接種外植體個數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基接種效果

外植體接種到培養(yǎng)基上，在設(shè)定的培養(yǎng)條件下光照培養(yǎng)。一周左右長出愈傷組織，數(shù)量不斷增多，體積膨大，顆粒化逐漸出現(xiàn)。培養(yǎng)基接種后生長狀況統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)基接種效果

2.2愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將銀杏嫩葉消毒后接種在三種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)。銀杏嫩葉所誘導(dǎo)的愈傷組織的生長周期約為30 d左右，其生長延緩期約為10 d，第10至25 d為快速生長期，25 d后進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期過后，愈傷組織很快衰老，變褐死亡。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選試驗中，圖1是在接種后第15 d的愈傷組織生長效果。

從圖1中可知，①號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織淡綠色、生長量少、顆?；缓苊黠@；②號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織淺黃綠色、生長量多、顆?；黠@、排列疏松；③號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織綠色、生長量多、顆粒化不明顯、排列緊密。結(jié)果表明，在相同種類水平生長素(NAA 2 mg/L)，相同種類較低水平細(xì)胞分裂素(KT ①號培養(yǎng)基1 mg/L，②號培養(yǎng)基0.1 mg/L)有利于愈傷組織生長，顆?；?；不同種類相同水平細(xì)胞分裂素(①號培養(yǎng)基KT 1 mg/L，③號培養(yǎng)基6-BA 1 mg/L)，6-BA有利于愈傷組織生長，但顆粒化不明顯，細(xì)胞排列密實；綜合比較三種培養(yǎng)基上愈傷組織生長狀況，②號培養(yǎng)基MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L比較適合銀杏嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)，所得愈傷組織相對較好，適合進一步后期的繼代培養(yǎng)或者細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究。

圖1 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織

3 討論與小結(jié)

植物生長所需要的培養(yǎng)基成分包括碳源、大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分和植物生長調(diào)節(jié)劑。因各種植物對營養(yǎng)成分的需要不同，培養(yǎng)基中各組分的濃度和不同組合，將對植物的生長產(chǎn)生不同的影響。為了選擇銀杏愈傷組織誘導(dǎo)生長的最適培養(yǎng)基，本試驗參考于榮敏等[6]、曉原等[7]和楊林等[8]的研究結(jié)果，在以往的研究基礎(chǔ)上，進一步分析了6-BA、KT、及NAA三種激素不同配比組合在愈傷組織誘導(dǎo)中的作用；通過培養(yǎng)基的篩選誘導(dǎo)愈傷組織，獲得了生長速度快、顆?；?、疏松的愈傷組織，得到的銀杏嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L，與于榮敏等[6]的研究結(jié)果相近。

[1]龐 允，楊建秀，劉子蘭.銀杏葉中黃酮的提取工藝比較[J].制劑技術(shù)，2007，16(3)：38～39.

[2]Tulecke W R. A tissue derived from the pollen ofGinkgobiloba[J]. Science. 1953，117: 559～600.

[3]羅紫娟.銀杳組織培養(yǎng)的韌步研究[J].云南植物研究，1984，6(1)：93～97.

[4]王德強，王曉玲.銀杏細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2005，24(3)：27～29.

[5]郭 勇，崔堂兵，謝秀禎.植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.7.

[6]于榮敏，趙鴻蓮，張 輝，等.銀杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其銀杏內(nèi)酯產(chǎn)生的研究[J].生物工程學(xué)報，1999，15(2)：207～210.

[7]曉 原，曹有龍.外部因子條件對麻黃細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2001，22(3)：48～52.

[8]楊 林，周吉源.銀杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及黃酮的產(chǎn)生[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002，11(1)：55～58.

10.3969/j.issn.1673-1409.2011.01.085

Q813.1;Q949.64

A

1673-1409(2011)01-0237-03

2010-09-21

國家自然科學(xué)基金項目(31000904)；湖北省教育廳高校產(chǎn)學(xué)研合作項目(XY2009B009)；湖北省自然科學(xué)基金項目(2009CDB232)；長江大學(xué)?；痦椖?2006Z2073)

張威威(1981-)，男，河南周口人，碩士生，研究方向為分子生物學(xué).

許 鋒，E-mail：xufeng198@126.com.