黃宏春 王秀敏 胡琳琳

重癥急性胰腺炎患者腸黏膜通透性的高壓液相色譜-示差法檢測

黃宏春 王秀敏 胡琳琳

腸黏膜屏障功能破壞、腸源性細(xì)菌易位是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)繼發(fā)感染以及引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及多臟器功能不全綜合征(MODS)的主要致病機(jī)制[1-3]。但目前尚缺乏檢測SAP腸黏膜屏障功能的有效方法。本文采用高壓液相色譜-示差法檢測SAP患者口服糖分子探針乳果糖(LAC)、甘露醇(MAN)后尿液排泄率比值(LAC/MAN)，評估患者腸黏膜屏障功能，現(xiàn)報道如下。

一、材料和方法

1．研究對象：46例SAP患者均為2008年1月至2009年8月我院住院患者，男33例，女13例，年齡21～77歲，平均(56±14)歲。同時以25例本院健康職工作為健康對照組。SAP診斷符合中華醫(yī)學(xué)會消化病分會胰腺病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

2．腸黏膜屏障功能的檢測：受試者于住院次日晨起排空尿液后空腹經(jīng)胃腸減壓管注入糖溶液(100 ml雙蒸水,5 g甘露醇,10 g乳果糖)。收集6 h尿液，計總量；取10 ml加少量防腐劑(硫柳汞：0.2 mg/ml)，置離心管，封口，-85°C保存待測。參考文獻(xiàn)[5]，采用高壓液相色譜儀(日本島津公司，LC-6A，配備RID-6A示差檢測器)檢測SAP患者尿液LAC/MAN，評估患者腸黏膜通透性。色譜條件：色譜柱為Nucleosil(美國)NH2柱，10 μm (4.6 mm×250 mm id)；流動相為乙腈-水(70∶30，v/v)，流速1 ml/min；柱溫35℃；示差檢測器內(nèi)加熱溫度為37℃，時間常數(shù)為1.0。

將冰凍貯存樣品解凍、混勻，取5 ml 3000 r/min離心10 min，取上清液3 ml加5%醋酸2～3滴加熱煮沸，冷卻后再5000 r/min離心10 min，取上清液2 ml經(jīng)陰陽離子交換樹脂去除離子、0.22 μl濾器過濾后，取0.2 ml尿樣品從進(jìn)樣口注入HPLC儀，由切換閥自動進(jìn)樣20 μl；當(dāng)聽到進(jìn)樣的聲音以后立即開始記錄，直至待測峰全部出現(xiàn)、基線平穩(wěn)后停止記錄。

以同樣處理后的正常尿液，加入5、10、25、50、100、200、500、1000 μg/ml的LAC和MAN。每樣濃度進(jìn)樣3次。根據(jù)峰面積(R)與相應(yīng)的濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。依據(jù)樣本的R計算C。

二、結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣本的色譜圖見圖1。

a:標(biāo)準(zhǔn)溶液；b:標(biāo)本；1:甘露醇；2：乳果糖

對照組尿液LAC%、MAN%及LAC/MAN值的變化分別為(0.175±0.010)%、(8.37±0.70)%及0.022±0.003；SAP患者分別為(0.719±0.04)%、(7.41±0.44)%及0.101±0.005。SAP患者尿液LAC%、LAC/MAN比值均顯著高于健康對照組(P值均<0.001)。

討論腸黏膜通透性是指腸黏膜上皮容易被某些分子物質(zhì)以簡單擴(kuò)散的方式通過的特性[3]。多項動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)，在多種急危重病狀態(tài)下，腸黏膜通透性是增加的，且往往與病情輕重相關(guān)[1-3]。

目前臨床和實(shí)驗(yàn)研究中用于測定腸黏膜通透性的分子探針主要有以下幾類：糖分子探針、同位素探針、聚乙二醇類分子探針(PEGS)[5-6]，其中測定LAC/MAN值是一種無創(chuàng)有效的方法，并可排除一些非特異因素，如胃排空、腸蠕動、腸黏膜表面積、心排出量和腎清除能力的影響，是目前公認(rèn)的檢測腸黏膜通透性較好的方法。一般認(rèn)為，LAC的通透性可反映腸黏膜的屏障功能，而MAN主要反映腸道的表面積[5-7]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，SAP患者LAC排泄率顯著升高，MAN排泄率無明顯改變。提示SAP可導(dǎo)致腸壁黏膜水腫，細(xì)胞間緊密連接發(fā)生水腫，與近期的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[7]。

雙糖試驗(yàn)的方法有很多。薄層色譜法是一種耗時、半定量的方法；氣-液色譜法需要復(fù)雜的柱前衍生；高壓液相色譜法省時，穩(wěn)定性好，可靠性高，儀器較普及，易于推廣[8]。本結(jié)果亦證實(shí)高壓液相色譜法進(jìn)行雙糖試驗(yàn)是檢測SAP患者腸黏膜通透性有效、可靠的方法。

[1] 程禮, 王興鵬, 汪佩文, 等. 保護(hù)腸屏障功能對重癥急性胰腺炎患者預(yù)后的影響. 胃腸病學(xué),2005,10: 24-26.

[2] 王興鵬, 龔自華.急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制新概念∥王興鵬.現(xiàn)代胃腸病學(xué).上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2001：90-108.

[3] 武金寶,王繼德,張亞歷.腸粘膜屏障研究進(jìn)展.世界華人消化雜志,2003,11:619-623.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會胰腺疾病學(xué)組.中國急性胰腺炎診治指南(草案).胃腸病學(xué),2004,9; 110-112.

[5] Kazunori M, Ross B, David M, et al. Rapid and simultaneous quantification of rhamnose mannitol and lactulose in urine by HPLC for estimating intestinal permeability in pediatric practice. Clinicl Chem,1996,42: 71-75.

[6] 王興鵬.急性胰腺炎實(shí)驗(yàn)與臨床研究現(xiàn)狀∥袁耀宗, 王興鵬.胰腺病學(xué)新進(jìn)展與新技術(shù).上海: 上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2001:106-127.

[7] 谷俊朝,周曉娜,王拒,等.谷氨酞胺對重癥急性胰腺炎大鼠腸道損傷影響的實(shí)驗(yàn)研究.中華肝膽外科雜志,2006,12,757-760.

[8] 鄧高月，劉振邦，徐燕英，等.高壓液相用于腸通透性的測定.中國微生態(tài)雜志,2000,12：242-244.

2009-10-09)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.020

455000 安陽，河南省安陽市人民醫(yī)院消化內(nèi)科