徐衛(wèi)東，王佩香，歐陽臻#，趙明，2，張磊，湯建明（.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市2203；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江市 2200）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化桑枝多糖提取工藝Δ

徐衛(wèi)東1＊，王佩香1，歐陽臻1#，趙明1，2，張磊1，湯建明1（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江市 212001）

目的：利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化桑枝多糖的提取工藝。方法：以桑枝多糖得率為指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)曲面法對提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)進行考察，優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝條件為提取溫度100℃、料液比1∶20、浸提時間2.5h、提取2次，實際測得的多糖得率為6.15%，與模型預(yù)測值基本相符。結(jié)論：模型可較好地預(yù)測桑枝多糖的得率，響應(yīng)曲面法對桑枝多糖提取條件參數(shù)優(yōu)化具有可行性。

桑枝多糖；提?。豁憫?yīng)曲面法

桑枝是?？浦参锷銶orus alba L.的干燥嫩枝，性微苦、平，歸肝經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、行水氣之功效[1]。桑枝所含化學(xué)成分種類較多，主要含有多糖、黃酮、生物堿和香豆素等?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑枝多糖具有降血糖[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]、抗氧化[4]等藥理活性。

響應(yīng)曲面法（Response Surface Method，RSM）是由Box等[5]于20世紀(jì)50年代提出的一種優(yōu)化工藝條件的有效方法。它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，確定各因素及其交互作用對各指標(biāo)的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。目前優(yōu)化多糖提取工藝多采用正交試驗法，而采用RSM優(yōu)化多糖提取工藝的研究較少[6～8]。本文采用RSM，通過考察關(guān)鍵工藝參數(shù)對桑枝多糖得率的影響，優(yōu)化其提取工藝。

1 儀器與試藥

SHB-111循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FD-1-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；240分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；TDL-5-A臺式離心機（上海金鵬分析儀器有限公司）。

桑枝采于江蘇大學(xué)桑樹園，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽臻教授鑒定為?？浦参锷銶.alba L.的干燥嫩枝，烘干，粉碎，備用；水為高純水，乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 桑枝多糖的提取工藝流程

桑枝→粉碎→熱水浸提→離心→上清液→減壓濃縮→醇析→離心→真空干燥→桑枝多糖粗品。稱量多糖粗品，作為多糖質(zhì)量。

2.2 桑枝多糖得率的計算

桑枝多糖得率＝多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%

2.3 單因素試驗

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選取對多糖得率有顯著影響的提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)為考察因素，以桑枝多糖得率為評價指標(biāo)，進行單因素試驗。

2.3.1 提取溫度對桑枝多糖得率的影響 稱取經(jīng)粉碎后的桑枝10g，置于500mL圓底燒瓶中，加水200mL煎煮2.5h，提取1次，分別考察不同溫度（60、70、80、90、100℃）對多糖得率的影響。結(jié)果，在60～100℃溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，多糖得率顯著增加；溫度升高到一定程度后，多糖得率變化不大，并且高溫可能使部分多糖降解，因此選擇提取溫度為90℃較適宜。

2.3.2 提取時間對桑枝多糖得率的影響 稱取經(jīng)粉碎后的桑枝10g，置于500mL圓底燒瓶中，加水200mL，90℃提取1次，分別考察提取不同時間（1、2、2.5、3、3.5、4h）對多糖得率的影響。結(jié)果，隨著時間的延長，多糖得率不斷增加，且在2.5h之前增加較為顯著，之后反而下降；隨著提取時間的延長，其他成分也同時被提取出，影響多糖的得率，因此選擇提取時間為2.5h較適宜。

2.3.3 料液比對桑枝多糖得率的影響 稱取經(jīng)粉碎后的桑枝10g，置于500mL圓底燒瓶中，90℃提取1次，提取2.5h，分別考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對多糖得率的影響。結(jié)果，在料液比較低時，多糖得率隨料液比的增大而顯著提高；在料液比1∶20時，多糖得率達到最高值；料液比超過1∶20后多糖得率沒有明顯增加，而加水量過大可使后續(xù)工序能耗增加、效率降低，因此選擇料液比1∶20為宜。

2.3.4 提取次數(shù)對桑枝多糖得率的影響 稱取經(jīng)粉碎后的桑枝10g，置于500mL圓底燒瓶中，加水200mL，90℃提取，提取2.5h，考察提取次數(shù)（1、2、3、4次）對多糖得率的影響。結(jié)果，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率顯著增加，但是提取3次后，多糖得率基本保持不變。

2.4 響應(yīng)面試驗

2.4.1 試驗設(shè)計 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，分別以X1、X2、X3和X4表示提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)，按方程Xi＝（Xi′－X0）/ΔX對自變量進行編碼。式中，Xi為變量的編碼值；Xi′為變量的真實值；X0為試驗中心點變量的真實值；ΔX為變量的變化步長，多糖得率（Y）為響應(yīng)值。每一自變量的低、中、高試驗水平分別以－1、0、+1進行編碼。因素水平及編碼見表1；試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平及編碼Tab 1 Factors，levels and codes of response surface method

表2 試驗設(shè)計方案及結(jié)果Tab 2 Design and results of experiment

如表2所示，共29個試驗點，其中24個為析因點，5個為零點，析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點。其中零點試驗重復(fù)5次，用以估算試驗誤差。

2.4.2 模型的建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到桑枝多糖對提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)的二次多項回歸模型為Y＝5.45640+0.86692X1+0.30450X2+0.46875X3+0.49950X4+0.24600X1X2+0.29475X1X3+0.17050X1X4+0.12250X2X3+0.49800X2X4－ 0.13650X3X4－0.60070X12－0.86282X22－0.40995X32－1.29608X42。對該模型和模型系數(shù)分別進行顯著性檢驗，結(jié)果分別見表3、表4。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis of regression model

表4 回歸模型系數(shù)的方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis of regression model coefficient

從表3可知，整體模型的P值＜0.001，表明該二次方程模型比較顯著；模型的失擬項的P值為0.6563＞0.05，說明模型選擇合適；并且該模型總回歸系數(shù)R2＝0.9250，說明該模型與實際試驗擬合較好，可以用于桑枝多糖熱水浸提試驗的理論預(yù)測。

從表4可知，模型的一次項提取溫度是極顯著的（P＜0.0001），一次項料液比和提取次數(shù)是高度顯著的（P＜0.01）；交叉項中提取時間和提取次數(shù)是顯著的（P＜0.05），而其余的交叉項則不顯著；二次項都是顯著的（P＜0.05），表明各個影響因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。

2.4.3 各因素間的交互影響 為了進一步研究相關(guān)變量之間的交互作用，筆者利用響應(yīng)面曲線圖和等高線圖來進行可視化的分析。6組圖分別顯示了不同交叉因素對桑枝多糖得率的交互影響趨勢，等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不明顯，而曲率半徑較大的橢圓則表示兩因素交互作用顯著，并且曲率半徑越大，交互作用越顯著，即橢圓越扁平，交互作用越顯著。在等高線圖上，最大的橢圓即最外圍的橢圓代表在該圓上取值時，多糖得率最低，而最小的橢圓則表示在其上面取值時，多糖得率最高，它們之間的等高線代表多糖得率逐漸變化，詳見圖1～圖6。

圖1 提取溫度與提取時間對多糖得率的影響A.響應(yīng)曲面；B.等高線Fig 1 Effects of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

圖2 提取溫度與料液比對多糖得率的影響A.響應(yīng)曲面；B.等高線Fig 2Effects of extracton temperature and solid-solvent ratio on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

圖3 提取溫度與提取次數(shù)對多糖得率的影響A.響應(yīng)曲面；B.等高線Fig 3 Effects of extraction temperature and extraction times on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

從圖1、圖2和圖4上可看出，在2個因素水平固定的條件下，3個圖中的其他兩因素交互作用不顯著。由6組圖可知，當(dāng)料液比一定和提取時間一定時，得率隨溫度的升高而增加；在提取溫度和料液比一定的條件下，得率隨提取次數(shù)的增加先增大后減小，這說明存在一個最佳的提取次數(shù)；當(dāng)料液比一定時，得率隨時間的延長逐漸增大，當(dāng)達到2.5h后，得率變化不大，說明它們的交互作用不顯著；當(dāng)提取次數(shù)一定時，得率隨溫度的升高變化不大，說明它們的交互作用不顯著。這與表4的因素方差分析結(jié)果相一致。

圖4 提取時間與料液比對多糖得率的影響A.響應(yīng)曲面；B.等高線Fig 4 Effects of extraction time and solid-solvent ratio on the yield of polysaccharides A.response surface；B.contour

圖5 提取時間與提取次數(shù)對多糖得率的影響A.響應(yīng)曲面；B.等高線Fig 5 Effects of extraction time and extraction times on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

圖6 料液比與提取次數(shù)對多糖得率的影響A.響應(yīng)曲面；B.等高線Fig 6 Effects of solid-solvent ratio and extraction times on the yield of polysaccharidesA.response surface；B.contour

2.4.4 最佳提取工藝條件的確定 結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，桑枝多糖最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度101.09℃、料液比1∶19.93、提取時間2.72h、提取次數(shù)2.31次?？紤]到實際操作條件，將桑枝多糖最佳提取條件修正為提取溫度100℃、料液比1∶20、浸提時間2.5h、提取2次，實際測得的多糖得率為6.15%，與理論預(yù)測值6.20%相比相差不大，表明回歸模型可較好地預(yù)測桑枝多糖得率。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果說明回歸模型可較好地預(yù)測桑枝多糖得率，從而也說明了RSM對桑枝多糖提取條件參數(shù)優(yōu)化的可行性。

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Optimization of the Extraction Technology of Morus alba Polysaccharide by Response Surface Method

XU Wei-dong，WANG Pei-xiang，OUYANG Zhen，ZHAO Ming，ZHANG Lei，TANG Jian-ming（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）
ZHAO Ming（The Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212001，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Morus alba polysaccharides by response surface method（RSM）.METHODS：Extraction temperature，extraction time，ratio of material to liquid and extraction times were investigated by single factor test and RSM using the yield of M.alba polysaccharides as index to optimize the extraction technology.RESULTS：The optimal condition obtained from RSM was as follow：extraction temperature 100℃，the ratio of material to water 1∶20，extraction time 2.5h，and extracting for 2times.The yield of polysaccharides was 6.15%，which was in line with predicted value basically.CONCLUSION：The model could well predict the yield of M.alba polysaccharides，and RSM is feasible to optimize the extraction technology of M.alba polysaccharides.

Morus alba polysaccharides；Extraction；Response surface method

R284.2；R282.6

A

1001-0408（2011）43-4064-04

2011-04-16

2011-06-15）