張振海，陳玲玲，賈曉斌，賀俊杰，金 鑫（江蘇省中醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，南京市 210028）

β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制備寶藿苷Ⅰ的工藝研究Δ

張振海＊，陳玲玲，賈曉斌#，賀俊杰，金 鑫（江蘇省中醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，南京市 210028）

目的：研究用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制備寶藿苷Ⅰ的工藝。方法：采用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制備寶藿苷Ⅰ，以轉化率為指標，通過單因素試驗考察溫度、pH值、酶與底物質量比、底物濃度和反應時間對轉化率的影響。結果：酶解反應的優(yōu)化條件為溫度50℃、pH＝5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液、酶與底物質量比1∶2、底物濃度1mg·mL-1、反應時間90min。結論：β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制備寶藿苷Ⅰ，轉化率高，工藝簡單、可靠，反應條件溫和。

淫羊藿苷；寶藿苷Ⅰ；β-葡萄糖苷酶；生物轉化

寶藿苷Ⅰ為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.中的一種多羥基黃酮類單體成分，有較好的抗肺癌細胞活性，明顯優(yōu)于淫羊藿中其他黃酮苷類化合物，亦有文獻報道其生物藥劑學性質明顯優(yōu)于淫羊藿中其他黃酮類多糖苷[1]。藥理研究表明，寶藿苷Ⅰ具有抗腫瘤、抗骨質疏松等作用[2～4]。有報道大鼠口服淫羊藿苷后在糞便和尿液中均檢出寶藿苷Ⅰ，推測大鼠腸菌酶可將淫羊藿苷轉化為寶藿苷Ⅰ，吸收入血的主要為寶藿苷Ⅰ[5]。寶藿苷Ⅰ在淫羊藿藥材中的含量較低，由于極性相當?shù)某煞趾芏?，故分離純化較困難。酶解反應具有選擇性高、反應條件溫和、轉化率高、分離純化容易、對環(huán)境無污染及成本低廉等優(yōu)點[6，7]。β-葡萄糖水解淫羊藿苷主要是C-7位去葡萄糖，能夠選擇性地切斷淫羊藿C-7位的β-D-葡萄糖，效果優(yōu)于纖維素酶。本試驗研究了β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制備寶藿苷Ⅰ的工藝，旨在為寶藿苷Ⅰ的工業(yè)化生產提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜（HPLC）儀，包括600型泵、717自動進樣器、2996DAD紫外檢測器、Empower數(shù)據處理系統(tǒng)（美國Waters公司）；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（金壇市雙捷實驗儀器廠）；AL204十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）。

淫羊藿苷（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號：ES20060310，純度＞98%）；纖維素酶、β-葡萄糖苷酶（夏盛實業(yè)集團有限公司）；柚皮苷酶（濟寧和美生物工程有限公司）；0.45μm微孔濾膜（江蘇漢邦科技有限公司）；寶藿苷Ⅰ標準品（筆者自制，純度＞98%）；甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

主要以淫羊藿苷為原料，選擇酶解能力較強的纖維素酶、柚皮苷酶與β-葡萄糖苷酶為水解酶，從中篩選出最佳酶系。

2.1 淫羊藿苷酶解工藝

精密稱取0.5g淫羊藿苷，置于50mL容量瓶中，純凈水定容，得10mg·mL-1的淫羊藿苷混懸液。分別稱取0.4g纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、柚皮苷酶置于10mL容量瓶中，純凈水定容，得濃度均為40mg·mL-1的各酶液。精密吸取適量的淫羊藿苷混懸液與1種酶液置于密閉容器中，反應液的pH值在酶水解活性范圍內，酶活性適宜溫度條件下，轉速為50r·min-1，振搖反應完全后加入乙醇，過濾后除去乙醇，得寶藿苷Ⅰ粗品。

2.2 分析方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（75∶25）；檢測波長：270nm；流量：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：20μL。在此色譜條件下分別進樣標準品和供試品溶液，結果寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷的保留時間分別為9.088、2.474min。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.寶藿苷Ⅰ標準品；B.酶解樣品；1.寶藿苷Ⅰ；2.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.baohuosideⅠ standard substance；B.enzymolysis sample；1.baohuosideⅠ；2.icariin

2.2.2 標準品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的寶藿苷Ⅰ標準品2.85mg，置10mL容量瓶中，加乙醇適量，超聲溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，得質量濃度為0.285mg·mL-1的標準品溶液，冰箱中貯藏，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 吸取淫羊藿苷混懸液和1種酶液置于10mL具塞試管中，加入一定的緩沖液，置于一定的溫度下，反應一定時間，加入乙醇終止反應，并定容至10mL，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾后即得供試品溶液。

2.2.4 線性關系考察 精密量取寶藿苷Ⅰ標準品溶液適量，分別置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，得濃度分別為142.50、71.25、35.62、17.81、8.90μg·mL-1的標準系列溶液。分別精密吸取各標準溶液及“2.2.2”項下溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以寶藿苷Ⅰ檢測濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝192784X+1840729（r＝0.9998，n＝5）。結果表明，寶藿苷Ⅰ檢測濃度在8.90～285.00μg·mL-1范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取71.25μg·mL-1的寶藿苷Ⅰ標準品溶液10μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結果，寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD＝0.11%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份配好的供試品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、8、12、24h進樣，按上述色譜條件測定。結果，寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD＝1.12%（n＝7），表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 按供試品溶液的制備項下操作，平行制備6份樣品，照上述色譜條件測定。結果，寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD＝1.56%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知寶藿苷Ⅰ濃度（濃度：0.3mg·mL-1）的供試品溶液6份，每份0.5mL，分別精密加入標準品溶液0.5mL，混勻后，照上述色譜條件測定，計算加樣回收率。結果，平均回收率為96.54%，RSD＝1.47%（n＝6）。

2.2.9 寶藿苷Ⅰ轉化率的測定寶藿苷Ⅰ轉化率＝cV/（m×M1/M2）×100%。式中，c為酶解后混懸液中寶藿苷Ⅰ的質量濃度；V為混懸液體積；m為酶解前淫羊藿苷的量（mg）；M1為寶藿苷Ⅰ的相對分子質量；M2為淫羊藿苷的相對分子質量。

2.3 酶系篩選

精密吸取10mg·mL-1的淫羊藿苷混懸液200μL，分別加入50μL β-葡萄糖苷酶液、纖維素酶液、柚皮苷酶液，再加入1.75mL pH值為5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液，置于10mL具塞試管中，置于50℃氣浴震蕩箱中反應12h后，加入8mL乙醇終止反應，計算寶藿苷Ⅰ的轉化率（每種酶系各平行做3份），結果見圖2。

圖2 各種酶對寶霍苷Ⅰ的轉化率（n＝3）Fig 2 Effect of different enzyme on the biotransformation of baohuosideⅠ（n＝3）

由圖2可以看出，在3種供試酶中，β-葡萄糖苷酶能在12h內將淫羊藿苷轉化為寶藿苷Ⅰ，且轉化率最高，達到100%，顯著高于其他2個酶系，故選擇β-葡萄糖苷酶作為最佳酶系。

2.4 β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷工藝研究

2.4.1 酶解反應最適溫度 精密吸取10mg·mL-1的淫羊藿苷混懸液200μL、β-葡萄糖苷酶液50μL、1.75mL pH值為5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液，置于10mL具塞試管中，分別于30、37、50、60、70℃反應50min后，加入8mL乙醇終止反應，計算寶藿苷Ⅰ轉化率（每個溫度各平行做3份），結果見圖3。

圖3 溫度對寶藿苷Ⅰ轉化率的影響（n＝3）Fig 3 Effect of temperature on the biotransformation of baohuosideⅠ（n＝3）

溫度是影響酶活力的一個重要因素，溫度過低時，酶活性受到抑制；在一定的溫度范圍內，升高溫度，使酶活化；溫度過高則會使部分酶蛋白失活。由圖3可知，寶藿苷Ⅰ轉化率在50℃時最高，表明50℃是β-葡萄糖苷酶的最適溫度點。

2.4.2 酶解反應最適pH值 分別配制pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、醋酸-醋酸鈉、枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖體系。在溫度為50℃條件下，精密吸取10mg·mL-1的淫羊藿苷混懸液 200μL、50μL β-葡萄糖苷酶液、1.75mL緩沖液，置于10mL具篩試管中，反應50min后加入8mL乙醇終止反應，計算寶藿苷Ⅰ轉化率（每個樣品各平行做3份），結果見圖4。

酶解反應過程中，緩沖液的離子會改變酶的構象，從而影響其活性。適宜的pH環(huán)境，可以保持酶最佳活性，以達到較高的轉化率。由圖4可知，在3種緩沖體系中，當pH值為5.0時，β-葡萄糖苷酶具有較高的活性，推測β-葡萄糖苷酶在偏酸性條件下具有較高的活性；在相同pH值即反應體系中具有相同的氫離子濃度條件下，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸-枸櫞酸三鈉體系中的寶藿苷Ⅰ的轉化率普遍高于其他2種體系。

2.4.3 酶與底物質量比對寶藿苷Ⅰ轉化率的影響 精密吸取10mg·mL-1的淫羊藿苷混懸液5mL，共6份，分別加入5、10、15、25、30、40、50mg β-葡萄糖苷酶，用pH值為5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液稀釋至50mL，在溫度為50℃條件下酶解50 min后，加入200mL乙醇終止反應，計算寶藿苷Ⅰ轉化率（每種質量比各平行做3份），結果見圖5。

圖4 pH對寶藿苷Ⅰ轉化率的影響（n＝3）a.枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖體系；b.磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系；c.醋酸-醋酸鈉緩沖體系Fig 4 Effect of pH values on the biotransformation of baohuosideⅠ（n＝3）a.citric acid-sodium citrate buffer；b.disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate buffer；c.acetate-sodium acetate buffer

圖5 酶與底物質量比對寶霍苷Ⅰ轉化率的影響（n＝3）Fig 5 Effect of ratio of enzyme to substract on the biotransformation of baohuosideⅠ（n＝3）

為保證底物與酶充分接觸，選擇合適的酶與底物質量比也是影響轉化率的關鍵。在溫度為50℃條件下，在pH值為5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液中，在淫羊藿苷的濃度為1mg·mL-1時，酶解反應50min，當β-葡萄糖苷酶與淫羊藿苷的質量比為1∶2時，寶藿苷Ⅰ轉化率達到最高，繼續(xù)增加酶的用量，轉化率沒有相應增加。2.4.4 底物濃度對寶藿苷Ⅰ轉化率的影響 按質量比1∶2稱取β-葡萄糖苷酶和淫羊藿苷，加入pH值為5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液中，配制成淫羊藿苷含量分別為10、5、3、2、1、0.5mg·mL-1的混懸液，在溫度為50℃條件下酶解50min后，加入乙醇終止反應，計算寶藿苷Ⅰ的轉化率（每種底物濃度各平行做3份），結果見圖6。

圖6 底物濃度對寶霍苷Ⅰ轉化率的影響（n＝3）Fig 6 Effect of substract concentration on the biotransformation of baohuosideⅠ（n＝3）

由圖6可知，底物濃度為1mg·mL-1時轉化率最高，較高和較低濃度時底物的轉化率均降低。

2.4.5 反應時間對寶藿苷Ⅰ轉化率的影響 按質量比1∶2稱取β-葡萄糖苷酶和淫羊藿苷，加入pH值為5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液中，配制成淫羊藿苷含量為1mg·mL-1的混懸液，在溫度為50℃條件下酶解，于 30、50、60、70、80、90min取樣，計算寶藿苷Ⅰ轉化率（每個時間點各平行做3份），結果見圖7。

圖7 反應時間對寶霍苷Ⅰ轉化率的影響（n＝3）Fig 7 Effect of reaction time on the biotransformation of baohuosideⅠ（n＝3）

由圖7可以看出，在50min以內，寶藿苷Ⅰ的轉化率達85.26%，隨著反應時間延長，寶藿苷Ⅰ轉化率也增加，到90min時寶藿苷Ⅰ的轉化率基本達到100%。

3 討論

本研究表明，β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、柚皮苷酶均可酶解淫羊藿苷制備得到寶藿苷Ⅰ，但在12h內，β-葡萄糖苷酶水解效果最好。為了解β-葡萄糖苷酶的性質，采用淫羊藿苷為底物，在淫羊藿苷的濃度為1mg·mL-1時，考察了溫度、pH、酶與底物質量比、底物濃度、反應時間對酶解反應的影響，得到優(yōu)化的工藝條件為溫度50℃，pH值為5.0的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液，酶與底物的質量比為1∶2，底物濃度為1mg·mL-1，此條件下酶解90min時淫羊藿苷基本100%轉化為寶藿苷Ⅰ。

本研究直接采用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制備寶藿苷Ⅰ，主要是C-7位去葡萄糖，β-葡萄糖苷酶能夠選擇性地切斷淫羊藿C-7位的β-D-葡萄糖。本試驗主要研究β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制備寶藿苷Ⅰ的工藝，旨在為更好地了解酶的性質和寶藿苷Ⅰ的工業(yè)化制備提供參考。

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Preparation Technology of Baohuoside Ⅰ by Enzymolysis of Icariin with β-glucosidase

ZHANG Zhen-hai，CHEN Ling-ling，JIA Xiao-bin，HE Jun-jie，JIN Xin（Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica，SACTM，Jiangsu Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China）

OBJECTIVE：To study the preparation technology of baohuoside Ⅰ by enzymolysis of icariin with β-glucosidase.METHODS：Taking bioconversion rate as index，β-glucosidase was used for enzymolysis of icariin and the effects of temperature，pH value，the ratio of enzyme to substrate，substrate concentration and reaction time on conversion rate of baohuosideⅠ were investigated by single factor test.RESULTS：The optimum reaction conditions were determined as follows：50℃，citric acid-citric acid sodium acetate buffer（pH 5.0），the ratio of enzyme to substrate 1∶2，substrate concentration 1mg·mL-1and reaction time 90min.CONCLUSION：It is simple and reliable to prepare baohuoside Ⅰ by the enzymolysis of icariin with β-glucosidase；the conversion rate is high and the technology is moderate.

Icariin；BaohuosideⅠ；β-glucosidase；Bioconversion

R284；R283

A

1001-0408（2011）43-4059-03

Δ國家自然科學基金資助項目（30973944）

＊助理研究員，博士。研究方向：天然藥物。電話：025-85608672。E-mail：davidpharm@yahoo.cn

#通訊作者：研究員，博士研究生導師。研究方向：天然藥物。電話：025-85608672。E-mail：jxiaobin2005@hotmail.com

2011-07-03

2011-08-19）