彌漫性腦損傷大鼠皮質(zhì)和海馬中BrdU和Nestin蛋白的表達(dá)

韓寧娟，張孝剛，楊 靜，張文娟，劉光旭，郭淑香，楊 波，張廣政#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州市公安局刑偵支隊(duì)鄭州450004 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科鄭州 450052

#通訊作者，男，1963年7月生，博士，副教授，研究方向:法醫(yī)臨床與司法精神病學(xué)，E-mail:zgz@zzu.edu.cn

彌漫性腦損傷大鼠皮質(zhì)和海馬中BrdU和Nestin蛋白的表達(dá)

韓寧娟1)，張孝剛2)，楊 靜1)，張文娟1)，劉光旭1)，郭淑香1)，楊 波3)，張廣政1)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州市公安局刑偵支隊(duì)鄭州450004 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科鄭州 450052

#通訊作者，男，1963年7月生，博士，副教授，研究方向:法醫(yī)臨床與司法精神病學(xué)，E-mail:zgz@zzu.edu.cn

彌漫性腦損傷;5-溴-2-脫氧尿苷;巢蛋白;損傷時(shí)間;大鼠

目的:觀察大鼠彌漫性腦損傷(DBI)后不同時(shí)間皮質(zhì)和海馬中5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(Nestin)蛋白的變化，探討其與腦損傷時(shí)間的關(guān)系。方法:成年健康SD大鼠36只，隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)和實(shí)驗(yàn)組(30只)。實(shí)驗(yàn)組大鼠制作DBI模型后用免疫組織化學(xué)方法觀察腦損傷后不同時(shí)間(1、3、7、14和28 d，n=6)皮質(zhì)和海馬中BrdU和Nestin蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠DBI后不同時(shí)間腦皮質(zhì)、海馬中的BrdU及Nestin陽(yáng)性細(xì)胞均增加(BrdU:F皮質(zhì)=141.447，F(xiàn)海馬=48.361，P均＜0.001;Nestin:F皮質(zhì)=94.159，F(xiàn)海馬=98.183，P均＜0.001)。傷后1 d，皮質(zhì)和海馬內(nèi)就有BrdU和Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的大量表達(dá);皮質(zhì)內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)于3 d達(dá)到高峰，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)于7 d達(dá)到高峰，均持續(xù)至第14天后開(kāi)始下降;海馬內(nèi)BrdU和Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)于第7天達(dá)到高峰，其后逐漸下降。結(jié)論:BrdU和Nestin蛋白表達(dá)所呈現(xiàn)出的時(shí)序性變化規(guī)律，可望用于DBI損傷時(shí)間的推斷。

閉合性彌漫性腦損傷(diffuse brain injury，DBI)是法醫(yī)實(shí)踐經(jīng)常遇到的一種顱腦損傷，這種類型的腦損傷無(wú)集中的腦挫傷表現(xiàn)，病理形態(tài)改變無(wú)明顯的時(shí)序性變化，需要尋找與其損傷相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)來(lái)幫助推斷損傷時(shí)間。目前，國(guó)內(nèi)法醫(yī)病理學(xué)者［1］對(duì)特異性蛋白在腦損傷后的變化規(guī)律有部分研究，但對(duì)DBI的研究較少。作者觀察了大鼠DBI后不同時(shí)間內(nèi)皮質(zhì)和海馬中5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(neuroepthelial stem cell protein，Nestin)表達(dá)的變化，探討其與腦損傷時(shí)間的關(guān)系，為DBI時(shí)間的鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 成年健康SD大鼠36只，雌雄不限，體質(zhì)量(250±20)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)和實(shí)驗(yàn)組(30只)。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)傷后不同時(shí)間取材，分為損傷后1、3、7、14和28 d組，每組6只。所有動(dòng)物室溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)組大鼠按改良的Marmarou法［2］制作DBI模型:用10 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，將其俯臥固定于已知厚度及彈性系數(shù)的海綿床上，用一特制鐵頭盔套于頭頂，頭盔中央對(duì)準(zhǔn)打擊管下口。待動(dòng)物開(kāi)始蘇醒，略有肢體活動(dòng)時(shí)，用450 g鐵棒從1.5 m高度自管內(nèi)自由墜落至特制頭盔正上方，立即移開(kāi)海綿床以免二次損傷。觀察打擊中及打擊前后動(dòng)物呼吸、肢體活動(dòng)及神經(jīng)體征的變化。對(duì)照組不予任何特殊處理，直接斷頭處死。

1.3 大鼠腦組織皮質(zhì)和海馬內(nèi)BrdU及Nestin的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死前1 d腹腔注射BrdU，共3次，每4 h 1次，每次50 mg/kg。各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死后經(jīng)心臟灌注肝素化生理鹽水10 min，然后用40 g/L多聚甲醛快速滴注20 min。心臟灌流后斷頭取腦組織，在大腦正中處作冠狀切面，取材厚度約5 mm，40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片厚度4 μm，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色、BrdU和Nestin免疫組織化學(xué)染色。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，使用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。鼠抗Brdu單克隆抗體、兔抗鼠Nestin多克隆抗體和即用型SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)，高倍視野下，每張切片選取4個(gè)不同視野(共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞)，分別對(duì)BrdU和Nestin陽(yáng)性細(xì)胞(胞核內(nèi)著棕黃色顆粒且密度不均者為Brdu陽(yáng)性細(xì)胞;細(xì)胞呈三角形或梭形、胞質(zhì)呈棕黃色為Nestin陽(yáng)性細(xì)胞)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先對(duì)每組數(shù)據(jù)作正態(tài)性檢驗(yàn)，再作方差齊性檢驗(yàn)。應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)比較大鼠DBI后不同時(shí)間海馬和皮質(zhì)BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)組大鼠受打擊后，多數(shù)出現(xiàn)即刻昏迷癥狀(聽(tīng)覺(jué)反射、痛覺(jué)反射和角膜反射均消失)，呼吸暫停數(shù)秒至數(shù)十秒，自主呼吸出現(xiàn)后由快到慢;大多動(dòng)物出現(xiàn)豎毛現(xiàn)象和數(shù)十秒甚至更長(zhǎng)時(shí)間的全身痙攣;完全蘇醒后以上癥狀會(huì)逐漸好轉(zhuǎn)，但普遍出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)和進(jìn)食減少的現(xiàn)象。

2.2 大鼠腦組織病理學(xué)變化 見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組損傷呈全腦彌漫性分布，損傷早期(第1天)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)出血點(diǎn);神經(jīng)元腫脹，體積增大，核膜不清，周?chē)霈F(xiàn)空隙;毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，炎癥細(xì)胞附壁。損傷后3 d可見(jiàn)腦組織疏松，神經(jīng)元周?chē)霈F(xiàn)較多間隙，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，損傷血管周?chē)梢?jiàn)大量淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞聚集。對(duì)照組未見(jiàn)明顯改變。

2.3 大鼠DBI后不同時(shí)間BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化 對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬存在少量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，散在分布，呈弱陽(yáng)性;Nestin在海馬區(qū)低水平表達(dá)，在皮質(zhì)內(nèi)無(wú)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組大鼠腦皮質(zhì)和海馬BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞增多。見(jiàn)圖2、表1。

表1 大鼠DBI不同時(shí)間BrdU和Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化 個(gè)

3 討論

BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期時(shí)，摻入到新合成的DNA中，可作為增殖細(xì)胞的標(biāo)記物。理論上，損傷后BrdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞可能與進(jìn)入凋亡細(xì)胞的BrdU及參與DNA修復(fù)的BrdU相混淆，但Moore等［3］研究發(fā)現(xiàn)BrdU僅在神經(jīng)發(fā)生時(shí)可檢出，在DNA修復(fù)峰期不能被檢出，所以可以用BrdU來(lái)觀察新生細(xì)胞的增殖變化。作者研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后1 d后，皮質(zhì)內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，3 d后達(dá)到高峰，一直持續(xù)到14 d后逐漸下降，至28 d后仍高于正常水平;腦損傷1 d后，海馬內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著增加，至7 d后達(dá)到高峰，14 d后開(kāi)始明顯下降，至28 d仍高于正常水平。從這一系列變化中也可以看出腦損傷后BrdU表達(dá)水平變化呈一定的時(shí)程規(guī)律性。

Nestin是一種胚胎時(shí)期表達(dá)的第Ⅵ類中間絲蛋白，為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物之一，主要存在于胚胎時(shí)期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，胚胎晚期隨著干細(xì)胞的分化成熟，逐漸被膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)絲蛋白等中間絲蛋白所代替。在機(jī)械性腦損傷、腦缺血及興奮性毒性腦損傷等應(yīng)激刺激下，神經(jīng)細(xì)胞可出現(xiàn)胚胎期的逆轉(zhuǎn)，特異性及一過(guò)性地表達(dá)Nestin蛋白［4］。屈建強(qiáng)等［5］研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腦挫傷后Nestin的表達(dá)具有一定的時(shí)序性。作者的研究結(jié)果顯示大鼠DBI后1 d，皮質(zhì)內(nèi)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始顯著增加，3 d后達(dá)到高峰，持續(xù)至14 d，損傷后28 d明顯下降，但仍高于對(duì)照組;海馬區(qū)Nestin陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)在損傷后1 d后明顯增加，7 d后達(dá)到高峰，一直持續(xù)至損傷后14 d。此結(jié)果與Chen等［6］的研究有所不同，與Urbach等［7］的研究結(jié)果基本一致。Chen等［6］研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后神經(jīng)前體細(xì)胞在傷后28 d恢復(fù)到對(duì)照組水平，Urbach等［7］發(fā)現(xiàn)腦損傷后神經(jīng)前體細(xì)胞增殖可持續(xù)至損傷后6周。以上結(jié)果有所不同可能與所選動(dòng)物種屬、月齡或損傷模型不同有關(guān)。

Nestin陽(yáng)性細(xì)胞可以看作是神經(jīng)干細(xì)胞，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞可以看作是增殖細(xì)胞，所以Nestin陽(yáng)性細(xì)胞和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的多少，也可以從一個(gè)方面反映DBI后大腦的自我修復(fù)能力的強(qiáng)弱。該研究結(jié)果顯示在正常成年大鼠腦組織中僅少數(shù)部位存在少量的Nestin和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，DBI后腦組織內(nèi)Nestin和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，并且隨時(shí)間變化有一定的時(shí)序性，提示其可能為判斷腦損傷時(shí)間提供一種新的指標(biāo)。在DBI發(fā)生后不同的時(shí)間段內(nèi)，由于它們具有靈敏性和時(shí)序性優(yōu)點(diǎn)，從而便于對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)觀察，所以其對(duì)DBI的診斷具有一定的參考價(jià)值。Nestin陽(yáng)性細(xì)胞和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的變化具有一定的趨勢(shì)性，如能進(jìn)一步研究出Nestin和BrdU增殖趨勢(shì)的平臺(tái)期，就可能推斷出腦損傷多久后腦細(xì)胞不再增殖，從而或許能為腦損傷傷殘鑒定的時(shí)限提供一定的理論依據(jù)。

該研究結(jié)果還顯示DBI后海馬及皮質(zhì)區(qū)BrdU和Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的變化雖大體趨勢(shì)一致，但具體變化不一致，二者結(jié)合使用，可為進(jìn)一步準(zhǔn)確推斷腦損傷形成時(shí)間及大腦損傷的程度提供可能。此外，由于作者現(xiàn)在的研究?jī)H局限于動(dòng)物模型，如需在人體中加以實(shí)際應(yīng)用尚有待進(jìn)一步研究。

［1］黃平，劉巖峰，托婭，等.大鼠彌漫性腦損傷后S100β表達(dá)與損傷時(shí)間關(guān)系［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(1):4

［2］ Marmarou A，F(xiàn)oda MA，van den Brink W，et al.A new model of diffuse brain injury of rats.PartⅠ:pathophysiology and biomechanics［J］.J Neurosurg，1994，80(2):291

［3］Moore N，Okocha F，Cui JK，et al.Homogeneous repair of nuclear genes after experimental stroke［J］.J Neurochem，2002，80(1):111

［4］Shi M，Wei LC，Cao R，et al.Enhancement of nestin protein-immunoreactivity induced by ionizing radiation in the forebrain ependymal regions of rats［J］.Neurosic Res，2002，44(4):475

［5］屈建強(qiáng)，賀西京，楊平林，等.成年大鼠液壓沖擊腦損傷誘導(dǎo)室下區(qū)Nestin和GFAP的表達(dá)［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004，25(5):436

［6］Chen S，Pickard JD，Harris NG.Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury［J］.Exp Neurol，2003，182(1):87

［7］Urbach A，Redecker C，Witte OW.Induction of neurogenesis in the adult dentate gyrus by cortical spreading depression［J］.Stroke，2008，39(11):3064

Expression of BrdU and Nestin protein in cortex and hippocampus of rats with diffuse brain injury

HAN Ningjuan1)，ZHANG Xiaogang2)，YANG Jing1)，ZHANG Wenjuan1)，LIU Guangxu1)，GUO Shuxiang1)，YANG Bo3)，ZHANG Guangzheng1)1)Department of Forensic Medicine，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)Department of Criminal Detection，Police Station of Zhengzhou City，Zhengzhou 4500043)Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

diffuse brain injury;BrdU;Nestin;injury time;rat

Aim:To observe the alteration of BrdU and Nestin positiveness cells in the diffuse brain injury(DBI)rat and its relation to the injury intervals.Methods:A total of 36 healthy adult SD rats were randomly divided into control and experimental groups.Based on Marmarou’s model of DBI and took the samples at 1 d，3 d，7 d，14 d，and 28 d after brain injury.The expressions of BrdU and Nestin were observed by immunohistochemical staining in combination with imaging analysis.Results:Compared with the control group，at 1 day post-trauma，a significant increase in BrdU and Nestin postive cells was observed in the cortex and hippocampus tissue(BrdU:FCortex=141.447，F(xiàn)Hippocampus=48.361，P＜0.001;Nestin: FCortex=94.159，F(xiàn)Hippocampus=98.18，P＜0.001).The expression level of BrdU peaked at 3 days after injury and Nestin peaked at 7 days after injury in cortex tissue，then they decreased gradully at 14 days after injury.The expression level of BrdU and Nestin peaked at 7 days in hippocampus tissue，then they decreased gradually.Conclusion:Time-order expression of BrdU and Nestin could be used to estimate the time of brain injury in forensic pathology.

DF795.1

(2010-03-12收稿 責(zé)任編輯趙秋民)