陳 雷

（淮南職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 安徽 淮南 232001）

靈芝膠囊中靈芝多糖的含量測定方法學(xué)研究

陳 雷

（淮南職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 安徽 淮南 232001）

為測定靈芝膠囊中的靈芝多糖含量,采用UV法測定;通過具體實(shí)驗(yàn),得出靈芝多糖線性范圍為0.001509～0.015091mg/ml,r=0.9987,加樣回收率為97.2%,RSD=1.50%（n=6）;因此,該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)靈芝膠囊多糖含量的有效控制。

靈芝膠囊; UV; 靈芝多糖

1 引言

靈芝膠囊收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第四冊(cè)）》,具有寧心安神,健脾和胃的功效。用于失眠健忘,身體虛弱,神經(jīng)衰弱等癥。靈芝膠囊為單味藥成方制劑,其中靈芝多糖為其主要活性物質(zhì)之一,其含量常作為評(píng)價(jià)一些中藥材及中藥制劑質(zhì)量的指標(biāo)。由于原標(biāo)準(zhǔn)僅收載了理化鑒別,難以有效控制制劑的質(zhì)量,本文建立了靈芝多糖的含量測定方法,為靈芝膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供有益的參考。

多糖的檢測方法可分為兩大類:用高效液相或酶法直接測定多糖本身;利用楊酸法、斐林法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法進(jìn)行測定。前者需要昂貴的儀器、多糖純品及特定的酶,操作步驟煩瑣,在應(yīng)用中受到限制。后者試劑簡單,操作簡便,靈敏度也適于微量測定的特點(diǎn),因而被廣泛采用。本文采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量,其原理是多糖在硫酸的作用下先水解成單糖分子,再脫水生成糖醛或羥甲基糖醛,然后蒽酮與糖醛或羥甲基糖醛經(jīng)脫水縮合,產(chǎn)生藍(lán)綠色的糖醛衍生物,其顏色的深淺與糖類含量成正比。

2 含量測定

多糖類化合物是靈芝的主要活性成分,有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用。參考《中國藥典2010年版一部》靈芝藥材“含量測定”項(xiàng)下方法,采用分光光度法測定制劑中靈芝多糖的含量。

2.1 儀器與試藥

上海分析儀器總廠生產(chǎn)的UV751-GD紫外分光光度計(jì);梅特勒—托利多儀器上海有限公司生產(chǎn)AB135-S型電子天平;購自中國藥品生物制品檢定所的 D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào):110833-200302）,供含量測定用;試藥為貴州益佰制藥股份有限公司靈芝膠囊（批號(hào):050617,050618,050619）;水為重蒸水,其余試劑均為分析純。

2.2 測量步驟

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖對(duì)照品約10mg,置100mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,得濃度為0.1056mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物約0.15g,研細(xì),精密稱定,加水80mL,超聲處理（功率250W,頻率50kHz）30 min,濾過,用適量水洗滌濾器及濾渣,洗液與濾液合并,轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻;精密量取1mL,置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方組成,取除靈芝外的各輔料,按制備工藝要求制成不含靈芝的靈芝膠囊,按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 檢測波長的確定

精密量取對(duì)照品溶液0.6mL,置10mL具塞試管中,加水至1.0mL,精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.2g,加80%的硫酸溶液100mL使溶解,搖勻）6mL,搖勻,置水浴中加熱30min,取出,放入冰浴中冷卻15min,以相應(yīng)的試劑為空白,在400-900nm波長處掃描,發(fā)現(xiàn)D-無水葡萄糖對(duì)照品在625nm處有較強(qiáng)吸收,參考中國藥典（2005版）上的檢測波長,故檢測波長定為625nm。

2.2.5 陰性干擾試驗(yàn)

量取陰性對(duì)照溶液,依法測定,陰性對(duì)照溶液不干擾主藥的含量測定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.6mL,置10mL具塞試管中,加水至1.0mL,精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.2g,加80%的硫酸溶液100mL使溶解,搖勻）6mL,搖勻,置水浴中加熱30min,取出,放入冰浴中冷卻15min,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可見分光光度法（附錄VA）,在625nm波長處測定吸光度,連續(xù)測定6次,測定結(jié)果見表1。結(jié)論:由表1可知,本方法重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 含量測定的方法學(xué)研究

3.1 線性范圍考察及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密量取對(duì)照品溶液（0.1056mg/mL） 0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0 mL,置10mL具塞試管中,加水至1.0mL,精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.2g,加80%的硫酸溶液100mL使溶解,搖勻）6mL,搖勻,置水浴中加熱30min,取出,放入冰浴中冷卻15min,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外—可見分光光度法（附錄VA）,在625nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定結(jié)果見表2。

表2 線性范圍考察表

以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),經(jīng)數(shù)據(jù)回歸處理得其標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,如圖1。其線性回歸方程為:y=69.02x+0.0003,相關(guān)系數(shù)r=0.9987。運(yùn)算結(jié)果表明:D-無水葡萄糖在濃度為0.001509～0.015091mg/mL的范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的相關(guān)性。

圖1 D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.6mL,按前文含量測定項(xiàng)下方法,重復(fù)測定6次。測定結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明:本方法精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（050617）的樣品6份,依法制得供試品溶液,按前文含量測定項(xiàng)下的方法測定供試液中靈芝多糖含量,測定結(jié)果見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明:本方法重現(xiàn)性良好。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液,于室溫條件下放置4h,每隔1h測定1次吸光度,測定結(jié)果見表5。試驗(yàn)結(jié)果表明:供試品溶液在4h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào):050617;含量:81.50 mg/粒）6份,每份取約0.075g,精密稱量,分別精密加入D-無水葡萄糖對(duì)照品25mg,加水80mL,超聲處理（功率250W,頻率50kHz）30min,濾過,用水洗滌濾器及濾渣,洗液與濾液合并,轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻;精密量取1mL,置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻即得。

按前文含量測定項(xiàng)下的方法測定,測定結(jié)果見表6。試驗(yàn)結(jié)果表明:本方法回收率良好。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 樣品測定

4.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖對(duì)照品適量,加水制成每1mL含0.1mg的溶液,即得。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取對(duì)照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4 mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,置10mL具塞試管中,加水至1.0mL,精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.2g,加80%的硫酸溶液100mL使溶解,搖勻）6mL,搖勻,置水浴中加熱30min,取出,放入冰浴中冷卻15min,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外—可見分光光度法（附錄VA）,在625nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.3 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物約0.15g,研細(xì),精密稱定,加水80mL,超聲處理（功率250W,頻率50kHz）30 min,濾過,用水洗滌濾器及濾渣,洗液與濾液合并,轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻;精密量取1mL,置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得。

4.4 測量結(jié)果

精密量取供試品溶液1mL,置10mL具塞試管中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“精密加入硫酸蒽酮溶液6mL”起,依法測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中D-無水葡萄糖的含量（mg）,計(jì)算,即得。結(jié)果如表7。

表7 三批樣品的靈芝多糖含量

以葡萄糖為對(duì)照、采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量時(shí)關(guān)鍵的操作環(huán)節(jié)是顯色。應(yīng)考慮四個(gè)因素:蒽酮的用量、濃硫酸的用量、反應(yīng)溫度（指水浴加熱溫度）和反應(yīng)時(shí)間（指水浴加熱時(shí)間）。有報(bào)道認(rèn)為,蒽酮和濃硫酸的用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)測定結(jié)果的影響并無顯著意義。由實(shí)驗(yàn)研究可知,濃硫酸比例越高,煮沸時(shí)間不宜過長,否則不僅消光度值降低,且靈敏度降低,測定誤差增大。這可能與加熱時(shí)間過長導(dǎo)致糠醛衍生物的破壞,顏色消退有關(guān)。從實(shí)驗(yàn)中也明顯觀察到隨著煮沸時(shí)間延長,反應(yīng)液褐色加重,而不是正常的藍(lán)綠色。本文所選顯色方式參照藥典靈芝藥材的含量測定方法。

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G284.1

B

1671-4733（2011）03-0065-03

10.3969/j.issn.1671-4733.2011.03.022

2011-05-26

陳雷（1983-）,男,安徽蚌埠人,助理講師,碩士在讀,從事教學(xué)工作,電話:13359037919。