人完全性葡萄胎中c-myc的表達及意義

張曉麗 趙舒武 王富武 邴魯軍 郝 晶＊

（1山東大學醫(yī)學院組胚教研室，濟南250012；2天津中醫(yī)藥大學組胚教研室，天津300193）

人完全性葡萄胎中c-myc的表達及意義

張曉麗1趙舒武2王富武1邴魯軍1郝 晶1＊

（1山東大學醫(yī)學院組胚教研室，濟南250012；2天津中醫(yī)藥大學組胚教研室，天津300193）

目的 研究c-myc基因在人完全性葡萄胎中的表達及其意義。方法 取人完全性葡萄胎30例，正常早孕流產標本10例，用SABC免疫組織化學染色方法，檢測c-myc基因在兩種組織中的表達情況，并采用圖像分析技術，對正常早孕絨毛組和完全性葡萄胎組c-myc的表達情況進行對比分析。結果 與正常絨毛相比，c-myc基因在完全性葡萄胎組織中的表達量和表達的空間特異性有明顯不同。結論 c-myc基因可能與完全性葡萄胎的發(fā)生密切相關。

c-myc基因；完全性葡萄胎；正常胎盤絨毛；免疫組化

完全性葡萄胎是在胚胎發(fā)生過程中，由于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞過度增生而形成的一種病理變化，以滋養(yǎng)層細胞異常增生、絨毛間質水腫及間質血管缺乏為主要特征。在某些方面，其生物學行為與腫瘤非常相似。在我國，發(fā)生率明顯高于歐美，因此研究某些癌基因在發(fā)生過程中的表達對闡明完全性葡萄胎的發(fā)生機制有非常重要的意義。本研究采用敏感性高、特異性強且操作快速簡便的免疫組織化學SABC方法，檢測了早期流產的正常胎盤絨毛和完全性葡萄胎組織中c-myc基因的表達情況，以探討c-myc基因的表達狀況與完全性葡萄胎發(fā)生的相關性。

材料和方法

1.材料

1.1 標本來源 30例完全性葡萄胎均為臨床首次清宮組織，孕齡為6-16周不等；同時收集6-12周早孕人工流產絨毛標本10例作為對照。標本來源：山東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院、山東省立醫(yī)院和一些縣、市級醫(yī)院的婦產科病人，病理診斷為完全性葡萄胎。正常胎盤絨毛標本取自山東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院計劃生育門診刮宮流產病例。

1.2 試劑 鼠抗人c-myc單克隆抗體及SABC免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

2.方法

2.1 免疫組織化學染色 所有標本經10%福爾馬林固定，石蠟切片7μm厚 ，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2封閉過氧化物酶，恒溫箱96℃-100℃20min進行抗原修復。滴加0.01mol／L pH7.4的PBS稀釋的c-myc一抗（1：100）4℃孵育過夜，陰性對照組以0.0lmol／L pH 7.4的PBS代替一抗。滴加0.01mol／L pH 7.4的PBS稀釋的二抗37℃孵育30min，最后室溫下DAB顯色，鏡下控制顯色時間，至陰性對照將著色時為止。期間各步均以0.0lmol／L pH 7.4的PBS洗滌3次，每次5min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.2 顯色結果判定 c-myc基因免疫組化陽性結果表現為滋養(yǎng)細胞胞質呈棕黃色，陰性對照不顯色。用彩色圖像分析系統(tǒng)對標本中陽性細胞進行定量分析：每張切片選10個高倍視野，每例共測10個細胞的陽性信號灰度值。將圖像分析所得數據ˉx±s表示。

2.3 統(tǒng)計學處理 用spss統(tǒng)計軟件進行方差分析。

結 果

正常早孕胎盤絨毛及完全性葡萄胎均有c-myc基因的陽性表達，定位于細胞質，呈棕黃色顆粒狀。劃分標準為：未著色為陰性（-），淺黃色著色為弱陽性（＋），黃色著色為中度陽性（＋＋），棕色著色為強陽性（＋＋＋ ）。

1.早孕絨毛組織免疫組化染色結果 正常絨毛染色深淺不一，淺染絨毛合體滋養(yǎng)層為弱陽性著色，細胞滋養(yǎng)層細胞為陽性著色；深染絨毛中細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細胞均為強陽性著色（圖1，2，3）。

2.完全性葡萄胎組織免疫組化染色結果 cmyc基因蛋白在完全性葡萄胎組織中所有絨毛染色類型相同，無深染絨毛和淺染絨毛之分，但在細胞著色類型上有差異：細胞滋養(yǎng)層和間質呈陰性著色，合體滋養(yǎng)層細胞呈強陽性著色（圖4，5，6）。

3.圖像分析和統(tǒng)計結果 染色標本經圖像分析系統(tǒng)處理，方差分析統(tǒng)計結果表明，完全性葡萄胎組織細胞滋養(yǎng)層c-myc基因表達強度和正常絨毛細胞滋養(yǎng)層細胞之間有差異（表1）；同時完全性葡萄胎合體滋養(yǎng)層細胞c-myc基因表達強度和正常絨毛中淺染絨毛中的合體滋養(yǎng)層細胞的表達也有明顯不同。

討 論

完全性葡萄胎是滋養(yǎng)細胞腫瘤中最常見的一型，對其病因學和發(fā)病學的研究，迄今為止仍停留在假說階段。劉麗君等研究了PCNA和Caspase3在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的表達及意義表明PCNA和Caspase3表達異常和增殖／凋亡失衡是引起妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的重要因素［1］。

已有報道，c-myc mRNA水平在不同細胞周期時相有很大差別，其轉錄速率僅在由G0期進入G1期時有較大程度的增高，而在其他細胞周期時相和細胞分化時均保持在大致相同的較低水平上［2～5］。

Pfeifer-Ohlsson［6］等發(fā)現，在人正常胎盤組織中，c-myc mRNA呈階段特異性表達，其在不同階段的表達水平可相差30倍；c-myc mRNA主要表達于細胞滋養(yǎng)層細胞。這與我們的免疫組化結果相符。我們的免疫組化染色結果還顯示，c-myc基因在正常早孕絨毛組織中的染色深淺不一，可能是由于不同部位的絨毛滋養(yǎng)層細胞處于不同的細胞周期時相和分裂、分化階段；染色較深的細胞，提示其細胞滋養(yǎng)層細胞可能分裂較活躍，而染色較淺的細胞，其分裂活性較低，或可能處于細胞間期或分化階段。

同時，我們還發(fā)現，完全性葡萄胎合體滋養(yǎng)層細胞中c-myc癌基因蛋白的表達強度遠遠高于細胞滋養(yǎng)層細胞，而在正常胎盤組織中，合體滋養(yǎng)層細胞細胞c-myc的表達低于細胞滋養(yǎng)層細胞。C-myc癌基因蛋白表達的這種細胞特異性是以往沒有報道過的，我們認為這可能就是c-myc癌基因蛋白在合體滋養(yǎng)層細胞的過度表達導致了完全性葡萄胎滋養(yǎng)層細胞的異常增生。

C-myc基因在正常組織中是細胞生長和細胞周期演進的一個正調控基因，也是調節(jié)細胞分化的關鍵基因，其過度表達不僅可促進細胞的增殖和惡性分化，同時還可以抑制細胞的正常分化。在正常胚胎發(fā)育過程中，細胞滋養(yǎng)層細胞是一種具有旺盛分裂增殖能力的細胞，其c-myc癌基因應有較豐富的表達，我們的結果也證實了這一點，說明c-myc基因確與細胞的增殖狀態(tài)有關。pfeifer-Ohlsson等［6］的結果也提示：c-myc轉錄與細胞滋養(yǎng)細胞增殖有關，可以作為胚胎細胞增殖的標志物。

本研究結果表明，完全性葡萄胎絨毛合體滋養(yǎng)層細胞中c-myc癌基因蛋白表達明顯增強，與細胞滋養(yǎng)層和間質之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同時與正常胎盤絨毛的c-myc蛋白表達之間差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。C-myc癌基因蛋白在完全性葡萄胎組織中表達量明顯高于正常絨毛組織，提示c-myc與完全性葡萄胎的發(fā)生、發(fā)展有關。它還可能有利于其它促增殖癌基因的變異，并使轉化的細胞生存下來，促進完全性葡萄胎的發(fā)生。

Fulop V等［7］發(fā)現正常胎盤、完全性葡萄胎和絨毛膜癌的合體滋養(yǎng)層染色均比部分性葡萄胎增強，得出結論，c-myc癌蛋白在完全性葡萄胎和絨毛膜癌的病理發(fā)生中起重要作用，而與部分性葡萄胎的發(fā)生可能無關。Yokoyama等［8］利用 Northern blot和原位雜交方法發(fā)現，c-myc基因在葡萄胎的合體滋養(yǎng)層細胞中有表達，這與我們的免疫組化染色結果相符。

Cheung A N 等［9］利用 Northern blot和免疫組化方法比較檢測了胎盤和葡萄胎中c-myc表達，發(fā)現c-myc在胎盤和葡萄胎組織中表達量均很低，與我們的結果不相符，可能與其所取胎盤孕齡較大及葡萄胎分型有關。李玉紅等［10］的結果表明c-myc基因表達的妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤可能具有更強的分裂增殖活動及浸潤能力；郭曉梅等［11］的實驗結果也證明c-myc基因可能參與滋養(yǎng)細胞由良性演變?yōu)閻盒缘倪^程；余志英等［12］的實驗結果也支持c-myc基因與妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)展及妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤臨床分期有關；劉金玲等［13］的實驗結果也說明c-myc基因蛋白的過度表達與水泡狀胎塊惡變有關。

我們的實驗結果表明，與正常早孕絨毛相比，cmyc基因蛋白在完全性葡萄胎組織中的表達部位和表達量均有明顯不同，結合以上分析得出結論，cmyc基因的表達與人完全性葡萄胎的發(fā)生密切相關，其激活可能是完全性葡萄胎發(fā)生的重要原因之一，還可能參與完全性葡萄胎的惡變。

圖1 正常絨毛c-myc免疫組化染色結果，示絨毛染色深淺不一，淺染絨毛中細胞滋養(yǎng)層細胞著色稍深，間質陰性表達，×100圖2 正常絨毛c-myc表達示深染絨毛，c-myc在細胞滋養(yǎng)層中的表達強度高于合體滋養(yǎng)層，×400圖3 正常絨毛c-myc表達示淺染絨毛中細胞滋養(yǎng)層c-myc表達強度高于合體滋養(yǎng)層，×400圖4 完全性葡萄胎絨毛組織c-myc免疫組化染色結果，示所有絨毛深染，×100圖5 完全性葡萄胎絨毛組織c-myc免疫組化染色結果，示細胞滋養(yǎng)層和間質呈陰性表達；合體滋養(yǎng)層細胞呈強陽性表達，×400圖6 完全性葡萄胎絨毛組織c-myc免疫組化染色結果，示細胞滋養(yǎng)層和間質呈陰性表達；合體滋養(yǎng)層細胞呈強陽性表達，蘇木素復染，×400

表1 完全性葡萄胎和正常絨毛c-myc蛋白免疫組化染色圖像分析和統(tǒng)計結果Table 1 Image Analysis of C-myc Expression by immunohistochemical staining method and Statistical Result in Complete Hydatidiform Mole and Normal Villi

［1］劉麗君，管英俊，趙司順，等.PCNA和Caspase-3在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的表達及意義.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18（6）：61-62

［2］Rabbitts PH，Watson JV，Lamond A，et al.Metabolism of c-myc gene products：c-myc mRNA and protein expression in the cell cycle.EMBO Journal，1985，4：2009-2015

［3］Thompson DM，Gill GN.The EGF recepter：structure，regulation and potential role in malignancy.Cancer Surveys，1985，4：767-788

［4］Thompson CB，Challoner PB，Neiman PE，et al.Levels of c-myc oncogene mRNA are invariant throughout the cell cycle.Nature，1985，314：363-366

［5］Kaczmarek L.Protooncogene expression during the cell cycle.Laboratory Investigation，1986，54：365-376

［6］Pfeiffer-Ohlssons，Goustin AS，Rydnert J，et al.Spatial and temporal pattern of cellular myc oncogene expression in developing human placenta：implications for embryonic cell proliferation.Cell，1984，38（2）：585-596

［7］Fulop V，Mok SC，Genest DR，et al.c-myc，c-erbB-2，c-fms and bcl-2oncoproteins.Expression in normal placenta，partial and complete mole，and choriocarcinoma .J Reprod Med，1998 ，43（2）：101-110

［8］Yokoyama S，Nimi S，Tsuruoka M，et al.The expression of c-myc，c-fms，c-sis oncogenes in the trophoblast of normal pregnancy and trophoblastic disease.Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi，1988，40（12）：1867-1874

［9］Cheung AN，Srivastava G，et al.Expression of c-myc and c-fms oncogenes in trophoblastic cells in hydatidiform mole and normal human placenta.J Clin Pathol，1993，6（3）：204-207

［10］李玉紅，趙向陽，梅立新，等.葡萄胎中c-myc和ras癌基因表達及其意義.解剖學研究，2002，24（3）：194-196

［11］郭笑梅，胡倫穎，高秉蘭，等.妊娠滋養(yǎng)細胞疾病c-myc基因的表達及其臨床意義.實用癌癥雜志，1998，13（4）：270-272

［12］余志英，漆秀梅，劉英，等.癌基因c-myc和n-ras在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中表達的研究.同濟醫(yī)科大學學報，2001，30（4）：363-365.

［13］劉玉玲，崔金全，李筱梅，等.正常胎盤及葡萄胎滋養(yǎng)細胞H-ras和C-myc基因產物表達.中國實用婦科與產科雜志，1998，14（4）：225-227.

Experimental Study of the Expression of C-myc Gene in Human Complete Hydatidiform Moles

Zhang Xiaoli1，Zhao Shuwu2，Wang Fuwu1，Bing Lujun1，Hao Jing1＊
（1Department of Histology and Embryology，Medical School，Shandong University，Jinan250012；2Department of Histology and Embryology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicince，Tianjin300193，China）

Objective To study the expression and significance of the c-myc gene in human complete hydatidiform moles.Methods 30hydatidiform moles and 10normal early-pregnancy aborted samples were obtained to detect the c-myc gene expression by using SABC immunohistochemical staining，and image analysis was used to analyze the c-myc expression in complete hydatidiform moles and normal villi.Results Compared with those of the normal villi，the amount and the spatial characteristics of c-myc gene expression in hydatidiform moles are quite different.Conclusion The c-myc gene may has a close relationship with the genesis of human complete hydatidiform moles.

C-myc gene；Hydatidiform mole；Placental Villus；Immunohistochemistry

R737.33

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.011

2011-05-05

2011-09-20

張曉麗，女（1972年），漢族，講師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）