趙 軍，徐曉陽(yáng)，林文弢，周 周

，

2mM肌酸孵育對(duì)電刺激C2C12肌管細(xì)胞糖原合成通路的影響

趙 軍1，2，徐曉陽(yáng)1，林文弢3，周 周1

，

目的：研究肌酸對(duì)骨骼肌糖原合成調(diào)節(jié)的影響及機(jī)制；方法：用培養(yǎng)的C2C12為細(xì)胞模型，用電刺激模擬神經(jīng)沖動(dòng)引起其收縮，測(cè)定肌酸孵育后電刺激下C2C12肌管細(xì)胞的糖原含量以及AMPKα1、HKII及GS－I等糖原合成通路中相關(guān)基因表達(dá)；結(jié)果：肌酸孵育能夠有效促進(jìn)電刺激下C2C12肌管糖原的合成，主要機(jī)制是糖原合成通路激活后，AMPKα1激活對(duì)糖原合成的正效應(yīng)。但2mM肌酸孵育可能觸發(fā)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制電刺激下C2C12肌管糖原合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)；結(jié)論：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示在體的肌酸補(bǔ)充能夠促進(jìn)骨骼肌糖原合成，增加肌糖原貯備，提高運(yùn)動(dòng)能力，為肌酸的合理補(bǔ)充提供參考依據(jù)。

C2C12肌管；肌酸；肌糖原；AMPKα1mRNA；HKII mRNA；GS－I mRNA

1992年，Harris［5］證明，口服肌酸能夠增加骨骼肌纖維內(nèi)肌酸含量以來，眾多研究表明，補(bǔ)充肌酸具有促進(jìn)骨骼肌收縮能力，提高短時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能力。肌酸促進(jìn)骨骼肌的糖原合成是其提高運(yùn)動(dòng)能力的重要因素之一［12］，并引來眾多學(xué)者的關(guān)注。目前，肌酸促進(jìn)骨骼肌糖原合成的具體機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)階段認(rèn)為，其可能的機(jī)制是：1）骨骼肌攝取肌酸后導(dǎo)致肌細(xì)胞體積漲大，激活糖原合成通路；2）肌酸促進(jìn)胰島素分泌增多，增加骨骼肌葡萄糖的吸收。對(duì)肌酸影響骨骼肌糖代謝進(jìn)行深入研究，不僅有利于增進(jìn)運(yùn)動(dòng)能力，而且肌酸促進(jìn)骨骼肌葡萄糖的吸收，改善高血糖的作用［8］，使其成為II型糖尿病治療的潛在手段。

電刺激C2C12細(xì)胞收縮與在體骨骼肌收縮有許多相同點(diǎn)，因此，可以作為研究骨骼肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的首選模型，通過肌酸孵育C2C12肌管細(xì)胞，避免了其他器官、組織和細(xì)胞對(duì)肌管細(xì)胞的影響，直接觀察到其糖代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的變化，為肌酸對(duì)糖代謝影響的機(jī)制研究提供了平臺(tái)。所以，本研究以C2C12肌管為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以2mM肌酸孵育48h和隨后一次性電刺激（15v，30ms，3Hz）60 min和120min對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，即刻收樣，測(cè)定C2C12肌管糖原含量以及AMPKα1、HKII及GS－I mRNA的表達(dá)，對(duì)肌管細(xì)胞糖原合成通路進(jìn)行研究。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C2C12細(xì)胞（小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系）購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)；L－谷氨酰胺、二甲基亞砜（DMSO）、肌酸、DEPC購(gòu)于美國(guó)sigma公司；4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）購(gòu)于MBCHEM公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；肌糖原、LDH測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；引物合成購(gòu)于廣州杰特偉生物有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于美國(guó)GeneCopoeia公司；2×AllinOneTM Q－PCR Mix購(gòu)于美國(guó)GeneCopoeia公司；Primer購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 電刺激方式及分組

C2C12細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)下，經(jīng)過復(fù)蘇、傳代、增殖，獲得增殖良好C2C12細(xì)胞。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞傳代，以2×105接種于35mm小皿，待細(xì)胞鋪滿80%～90%皿底面積后，再加入分化培養(yǎng)基孵育5天，然后分組培養(yǎng)，按照電刺激不同，分為2個(gè)正常對(duì)照組（C組），電刺激組（60min E、120min E組），2個(gè)單純肌酸組（Cr）和肌酸＋電刺激組（60min Cr＋E、120 min Cr＋E），共8組。肌酸組加入2mM肌酸的DMEM培養(yǎng)基，孵育48h，其余組加入分化培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

采用GRASS S48Stimulator型電刺激器電刺激分化7天的E組和Cr＋E組C2C12肌管，強(qiáng)度為15V、30ms、3Hz，其余各組不刺激，電刺激時(shí)間分別為60min、120 min。電刺激時(shí)，其余各組繼續(xù)正常培養(yǎng)，電刺激結(jié)束后，即刻收樣，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟及要求，測(cè)定C2C12肌管糖原含量以及AMPKα1、HKII及GS－I mRNA的水平。

1.3 C2C12細(xì)胞增殖及分化過程中形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下觀察并用數(shù)碼相機(jī)拍照，對(duì)其形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。

1.4 C2C12肌管上清液LDH活性的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所提供的乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒，用細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為樣本。依照試劑盒說明書測(cè)定C2C12肌管上清培養(yǎng)液中的LDH活性。

1.5 C2C12肌管糖原含量的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所提供的肌糖原測(cè)定試劑盒，依照說明書測(cè)定肌糖原含量。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定C2C12肌管AMPKα1、HKII及GS－I mRNA水平

1.總RNA的提取：實(shí)驗(yàn)處理完成后收集35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞樣品，完全吸走細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至含有1ml Trizol的離心管中，采用Trizol一步法提取總RNA，行瓊脂凝電泳檢測(cè)，通過紫外測(cè)定其濃度和純度，以DEPC水做空白對(duì)照，記錄RNA濃度和OD260／OD280。

2.mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：根據(jù)不同樣本RNA濃度和終濃度計(jì)算樣本總RNA的體積，加入250μmolRD引物1μl，再加入焦磷酸二乙酯（DEPC）處理的無(wú)菌純水至總體積13μl，65℃變性10min，立即置于冰上冷卻；配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：在RNA－Primer Mix反應(yīng)管內(nèi)加入5х反應(yīng)緩沖液5μl、25mmol dNDP 1μl、25U／μl RNase抑制劑1μl、200U／μl M－MLV RTase 1μl、加入DEPC處理的無(wú)菌純水4μl至總體積的25μl。混勻，短暫離心后37℃孵育1h，85℃滅活處理5min，最后－20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物備用。

3.PCR引物的合成（表1）：以GAPDH為內(nèi)參照。

表1 本研究各引物序列及大小一覽表Table 1 The primer design of AMPKα1，HKII，GS－I，and GAPDH

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增：將2×AllinOneTM QPCR Mix在室溫下融解，取10μl加入上下游引物（0.4 μmol）各2μl，cDNA（1：10稀釋）5μl，無(wú)菌去離子水（ddH2O）1μl至PCR反應(yīng)體系為20μl?；靹蚝蠹尤?6孔板中短暫離心，采用標(biāo)準(zhǔn)三步法程序進(jìn)行PCR。擴(kuò)增條件：93℃預(yù)變性10min，93℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI PRISM 7000sequence detection system實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，72℃～95℃緩慢升溫，產(chǎn)生相應(yīng)指標(biāo)的融解曲線，重復(fù)檢測(cè)2次。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物：采用儀器自帶的軟件進(jìn)行分析，觀察擴(kuò)增曲線和融解曲線，以GAPDH為內(nèi)參基因，對(duì)cDNA的含量進(jìn)行相對(duì)定量分析，計(jì)算樣本的△△Ct值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組的數(shù)據(jù)資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，并用單因素方差分析進(jìn)行各組間的差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果分析

2.1 C2C12細(xì)胞增殖、分化及肌酸孵育過程中形態(tài)的變化

C2C12細(xì)胞為梭形貼壁細(xì)胞，增殖期的第3至4天，細(xì)胞密度即可長(zhǎng)至皿底面積的95%。分化第2天，肌管即清晰可見，第5天肌管遍布整個(gè)視野。肌酸孵育24h，可見肌管更為粗大，數(shù)目增多，排列整齊（圖1～圖4）。

圖1 本研究C2C12細(xì)胞電鏡圖Figure 1 C2C12Cell

圖2 本研究細(xì)胞分化2天電鏡圖Figure 2 Cell differentiation for 2days

圖3 本研究細(xì)胞分化5天電鏡圖Figure 3 Cell differentiation for 5days

圖4 本研究肌酸孵育24h電鏡圖Figure 4 Creatine incubation for 24h

2.2 電刺激C2C12肌管糖原含量、LDH活性的變化

在確定電刺激強(qiáng)度和時(shí)間的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，15V、30ms、3Hz強(qiáng)度的電刺激60min后，分化7天的肌管糖原含量稍高于對(duì)照組；電刺激120min，糖原含量顯著性降低；120min的電刺激對(duì)培養(yǎng)上清液中LDH水平?jīng)]有顯著性影響（表2）。

2.3 2mM肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管糖原含量的影響

分化7天的肌管細(xì)胞電刺激120min后，E組較C組糖原含量顯著性降低（P＜0.05）。肌酸孵育對(duì)無(wú)電刺激的肌管糖原含量的影響甚微，Cr組分別與C組相比無(wú)顯著性差異；肌酸孵育可以明顯抑制電刺激120min后肌管糖原含量的下降趨勢(shì)，由0.3795±0.0248升高至0.4575 ±0.0945（P＜0.05）；電刺激60min的Cr＋E組也較E組略高（0.1711±0.0169和0.1597±0.0073），但無(wú)顯著性差異（表3）。

2.4 2mM肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管AMPKα1mRNA表達(dá)的影響

從圖5、圖6可以看出，AMPKα1的各個(gè)樣本擴(kuò)增效果良好。

表2 本研究不同電刺激時(shí)間對(duì)糖原含量、LDH活性的影響一覽表Table 2 The effect of different electrical stimulation duration on glycogen and activity of LDH of C2C12cell

表3 本研究2M肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管糖原含量的影響一覽表Table 3. The effect of 2Mcreatine incubation and different electrical stimulation duration on the content of glycogen of C2C12cell （mg／g）

圖5 本研究AMPKα1擴(kuò)增曲線圖Figure 5. Amplification curve of AMPKα1

圖6 本研究AMPKα1溶解曲線圖Figure 6. Solubility curve of AMPKα1

電刺激60min后，E組、Cr＋E組AMPKα1mRNA表達(dá)均極顯著高于C組（P＜0.01），分別是對(duì)照組的5.03倍、5.26倍；Cr組AMPKα1mRNA表達(dá)顯著高于C組（P＜0.05）；Cr＋E組AMPKα1mRNA表達(dá)有極顯著高于Cr組的趨勢(shì)（P＜0.01）。電刺激120min后，E組、Cr組、Cr＋E組AMPKα1mRNA表達(dá)極顯著高于C組（P＜0.01），分別是對(duì)照組的4.68倍、4.96倍、5.69倍。結(jié)果表明，肌酸孵育和電刺激均能顯著性促進(jìn)肌管AMPKα1的基因表達(dá)，并且肌酸和電刺激的正效應(yīng)可以累加（表4）。

表4 本研究2M肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管AMPKα1mRNA相對(duì)表達(dá)率的影響一覽表Table 4. The effect of 2Mcreatine incubation and different electrical stimulation duration on the relative expression of AMPKα1mRNA of C2C12cell

2.5 2mM肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管HKIIm－RNA表達(dá)的影響

從圖7和圖8可以看出，HKII的各個(gè)樣本擴(kuò)增效果良好。

電刺激60min后，E組、Cr＋E組HKIImRNA表達(dá)均極顯著高于C組（P＜0.01），分別是對(duì)照組的3.65倍、1.98倍；Cr＋E組HKIImRNA表達(dá)與E組相比有顯著下降（P＜0.05）。電刺激120min后，各組HKIImRNA表達(dá)與C組相比均無(wú)顯著性差異（P＞0.05，表5）。

表5 本研究2M肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管HKIImRNA相對(duì)表達(dá)率的影響一覽表Table 5. The effect of 2Mcreatine incubation and different electrical stimulation duration on the relative expression of HKIImRNA of C2C12cell

2.6 2mM肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管GS－ImRNA表達(dá)的影響

從圖9和圖10可以看出，GS－I的各個(gè)樣本擴(kuò)增效果良好。

圖7 本研究HKII擴(kuò)增曲線圖Figure 7. Amplification curve of HKII

圖8 本研究HKII溶解曲線圖Figure 8. Solubility curve of HKII

圖9 本研究GS－I擴(kuò)增曲線圖Figure 9. Amplification curve of GS－I

圖10 本研究GS－I溶解曲線圖Figure 10. Solubility curve of GS－I

電刺激60min后，E組、Cr＋E組GS－ImRNA表達(dá)分別極顯著性和顯著性高于C組，分別是C組的2.36倍、1.84倍；Cr＋E組與E組相比，GS－ImRNA表達(dá)極顯著的下降（P＜0.01）。電刺激120min后，E組GS－ImRNA表達(dá)極顯著高于C組（P＜0.01），約是C組的2倍；Cr組、Cr＋E組與E組相比，GS－ImRNA表達(dá)有顯著的下降（P＜0.05，表6）。

表6 本研究2M肌酸孵育對(duì)不同電刺激下C2C12肌管GS－ImRNA相對(duì)表達(dá)率的影響一覽表Table 6. The effect of 2Mcreatine incubation and different electrical stimulation duration on the relative expression of GS－ImRNA of C2C12cell

3 討論

肌酸作為一種天然的促力營(yíng)養(yǎng)物，對(duì)骨骼肌的物質(zhì)和能量代謝有重要的作用。本研究在電刺激模擬運(yùn)動(dòng)的前提下，通過離體的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討在細(xì)胞水平下補(bǔ)充肌酸對(duì)肌管細(xì)胞糖代謝的影響。實(shí)驗(yàn)通過即刻測(cè)得指標(biāo)，從而避免了其他因素的干擾。

實(shí)驗(yàn)之前，首先對(duì)肌酸的濃度和電刺激條件進(jìn)行了摸索。目前運(yùn)動(dòng)員補(bǔ)充肌酸，常用的推薦方案是以沖擊劑量（20g／人／天）服用5～7天，然后以維持量繼續(xù)服用。根據(jù)Ceddia RB等［3］研究，0.5mM濃度的肌酸孵育L6細(xì)胞相當(dāng)于人一次口服5g劑量，經(jīng)過換算，2mM肌酸相當(dāng)于人體服用肌酸的沖擊劑量。

電刺激肌管能夠產(chǎn)生與在體肌肉同樣的收縮反應(yīng)及代謝變化，而不同電刺激強(qiáng)度所引起的變化卻并不相同。根據(jù)文獻(xiàn)［4］和本實(shí)驗(yàn)組以前的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)［1］，本實(shí)驗(yàn)采用強(qiáng)度為15V，30ms，3Hz的電刺激。因?yàn)樵陬A(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)135min和150min電刺激C2C12肌管后，均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大片脫落死亡，所以，選取電刺激的時(shí)間是60min和120 min，而且培養(yǎng)上清液的LDH濃度反映肌管細(xì)胞在該強(qiáng)度和時(shí)間的電刺激下，細(xì)胞損傷程度較小。

肌糖原的變化與運(yùn)動(dòng)時(shí)間有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中，電刺激組C2C12肌管糖原的含量與對(duì)照組相比，隨著電刺激時(shí)間延長(zhǎng)，糖原含量呈下降趨勢(shì)，且電刺激120min糖原含量與對(duì)照組相比有顯著降低（P＜0.05）；這與在體研究中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，糖原消耗明顯增加的反應(yīng)是相似的。60min電刺激E組糖原含量略高于對(duì)照組，可能是由于電刺激時(shí)間相對(duì)較短，肌管的糖原消耗不是很明顯，適當(dāng)?shù)碾姶碳た赡芗せ盍颂窃铣傻囊恍┱{(diào)控分子或酶蛋白，并且在電刺激過程中不斷有高糖培養(yǎng)基來補(bǔ)充，故糖原合成有所增加。

本實(shí)驗(yàn)中，2mM肌酸孵育能夠明顯改善120min電刺激導(dǎo)致的肌管細(xì)胞內(nèi)糖原含量下降的趨勢(shì)，說明2mM肌酸孵育48h能夠促進(jìn)電刺激下肌管細(xì)胞的糖原合成通路；但肌酸孵育48h對(duì)無(wú)電刺激的肌管糖原含量無(wú)顯著性影響，這與Ceddia RB［3］的結(jié)果是相一致的。以前研究［9，10］發(fā)現(xiàn)，肌酸補(bǔ)充能夠明顯增加骨骼肌糖原含量，但都是建立在骨骼肌收縮的基礎(chǔ)之上；對(duì)于沒有運(yùn)動(dòng)刺激的情況下，單純補(bǔ)充肌酸并不能明顯增加骨骼肌糖原含量：如Young C等［14］給安靜大鼠補(bǔ)充肌酸并不能增加骨骼肌糖原；Rooney K等［13］也發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充肌酸對(duì)骨骼肌糖原合成酶活性也沒有影響。究其原因，可能是只有當(dāng)骨骼肌內(nèi)糖原含量明顯下降，其糖原合成通路被充分激活后，肌酸促進(jìn)糖原合成的效應(yīng)才會(huì)顯現(xiàn)，促進(jìn)骨骼肌的糖原合成；但如果肌細(xì)胞糖原含量變化不大時(shí)，糖原合成通路的各個(gè)調(diào)控因子及酶蛋白活性沒有被充分激活，肌酸就不可能促進(jìn)肌細(xì)胞的糖原合成。

肌酸是如何促進(jìn)骨骼肌收縮后糖原合成的呢？首先，骨骼肌糖原合成通路中，AMPK、HKII、GS－I均起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。AMPK是一種多功能的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，它是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的AMP／ATP升高時(shí)，會(huì)使AMPK發(fā)生磷酸化而激活。肌肉收縮會(huì)導(dǎo)致肌細(xì)胞的AMPK磷酸化、AMPKmRNA表達(dá)增加。AMPK活性也可能受到細(xì)胞內(nèi)PCr／TCr比率的影響［11］，補(bǔ)充肌酸會(huì)增加肌細(xì)胞內(nèi)TCr，降低PCr／TCr比率，從而激活A(yù)MPK。α亞單位是AMPK主要的催化亞基，AMPK的上游激酶LKBI可以通過磷酸化AMPKα亞基的172蘇氨酸殘基特異性激活A(yù)MPK。AMPK激活的主要作用是促進(jìn)能量物質(zhì)的分解，以生成更多的ATP；pAMPK可以激活骨骼肌HKII［2］，抑制GS－I［7］。HKII主要表達(dá)于骨骼肌和脂肪組織，主要作用是催化葡萄糖磷酸化，生成6－磷酸葡萄糖（G6P）。G6P既可進(jìn)入糖酵解途徑，也可轉(zhuǎn)化成1－磷酸葡萄糖，經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）途徑進(jìn)入糖原合成通路。GS是肝和肌肉糖原的限速酶，胰島素可以使糖原合成酶去磷酸化而被激活，促進(jìn)糖原的合成。骨骼肌中主要表達(dá)GS－I。GS－I是催化葡萄糖經(jīng)UDPG轉(zhuǎn)變成糖原的關(guān)鍵酶，在糖原合成的一系列步驟中，GS－I的活力調(diào)節(jié)很復(fù)雜，既包括變構(gòu)調(diào)節(jié)，也包括共價(jià)調(diào)節(jié)。

其次，Hunter RW［6］通過轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)提出以下假設(shè)：長(zhǎng)時(shí)間AMPK激活可以導(dǎo)致骨骼肌糖原合成增加，其機(jī)制主要是，AMPK活性持續(xù)性升高，導(dǎo)致葡萄糖攝取增加；而當(dāng)肌細(xì)胞利用葡萄糖釋能通路沒有同比例增加時(shí)，會(huì)引起肌細(xì)胞內(nèi)G6P積累。G6P對(duì)GS有持續(xù)性變構(gòu)作用，增加GS活性，超過AMPK對(duì)GS的抑制性作用，GS活性反而升高，從而使肌細(xì)胞內(nèi)糖原合成增加。

圖11 AMPK介導(dǎo)骨骼肌糖原合成的可能機(jī)制示意圖（引自Hunter RW［6］）Figure 11. The possible mechanism of muscle glycogen synthesis mediated by AMPK

最后，本實(shí)驗(yàn)表明，電刺激引起的肌管收縮后，其AMPKα1mRNA表達(dá)顯著性升高，同時(shí)，HKIImRNA、GSImRNA也升高，說明隨著肌管糖原減少，糖原合成通路代償性激活，促進(jìn)了相關(guān)酶基因表達(dá)；2mM肌酸孵育48h后，由于細(xì)胞內(nèi)PCr／TCr比率增加，電刺激下AMPK活性更顯著性升高，促進(jìn)HKII酶蛋白活性，生成更多的G6P，而G6P積累會(huì)抵消AMPK對(duì)GS－I的抑制作用，從而促進(jìn)更多的糖原合成，導(dǎo)致肌酸促進(jìn)糖原合成的正協(xié)同效應(yīng)。所以，筆者認(rèn)為，肌酸促進(jìn)骨骼肌糖原合成包含2個(gè)必要條件：1）肌酸促進(jìn)AMPK活性增加；2）糖原合成通路已經(jīng)激活。

2mM肌酸孵育48h后，60min、120min電刺激組盡管肌管糖原含量、AMPKα1mRNA與無(wú)肌酸孵育的電刺激組相比升高，但是，肌管細(xì)胞內(nèi)HKIImRNA和GS－1mRNA并沒有同步性升高，反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與糖原含量、AMPKα1mRNA增加出現(xiàn)相左的情況?？紤]到2mM肌酸濃度相當(dāng)于人體口服時(shí)的沖擊劑量，肌酸孵育48h后肌管細(xì)胞內(nèi)肌酸濃度較高，在電刺激和PCr／TCr比率急劇降低情況下，肌酸促進(jìn)肌糖原合成的正效應(yīng)可能接近峰值，肌管內(nèi)糖原合成的速率達(dá)到比較高的水平，此時(shí)很有可能激活了糖原合成通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而降低HKII、GS－ImRNA表達(dá)，使糖原合成不致過度旺盛，影響細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)；此外，也不能排除肌管內(nèi)高濃度肌酸會(huì)直接抑制HKII、GS－ImRNA表達(dá)，和／或是由于長(zhǎng)時(shí)間電刺激導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)高濃度肌酸分解產(chǎn)物對(duì)HKII、GS－I基因表達(dá)的抑制作用。

4 小結(jié)

1.以電刺激方式來模擬神經(jīng)沖動(dòng)，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，C2C12肌管糖原消耗增大。電刺激120min時(shí)，肌管可能與在體非力竭性運(yùn)動(dòng)能量代謝變化情況相似。電刺激前肌酸孵育48h，能夠有效促進(jìn)C2C12肌管糖原的合成，并保持電刺激期間糖原維持在較高水平。

2.肌酸能促進(jìn)骨骼肌糖原合成，其主要機(jī)制是在糖原合成通路激活的條件下，AMPKα1激活對(duì)糖原合成的正效應(yīng)。

3.2mM肌酸孵育可能會(huì)使電刺激下C2C12肌管的糖原合成達(dá)到較高程度，反而會(huì)產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，抑制相關(guān)酶蛋白基因的表達(dá)，不利于后期肌糖原的合成。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)提示，肌酸的補(bǔ)充能夠促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌糖原合成的速率，增進(jìn)補(bǔ)糖的效果，延緩骨骼肌糖原的減少，為長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)提供能源物質(zhì)，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間；補(bǔ)充肌酸，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后肌糖原的超量恢復(fù)。

［1］潘紅英，徐曉陽(yáng)，劉承宜，等.電刺激C2C12細(xì)胞時(shí)活性氧生成的變化［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，25（1）：46－49.

［2］ABNOUS K，STOREY K B.Skeletal muscle hexokinase：regulation in mammalian hibernation［J］.Mol Cell Biochem，2008，319（1－2）：41－50.

［3］CEDDIA RB，SWEENEY G.Creatine supplementation increases glucose oxidation and AMPK phosphorylation and reduces lactate production in L6rat skeletal muscle cells［J］.J Physiol，2004，555（Pt 2）：409－421.

［4］FROST R A，NYSTROM G J，LANG C H.Tumor necrosis factor－alpha decreases insulin－like growth factor－I messenger ribonucleic acid expression in C2C12myoblasts via a Jun N－terminal kinase pathway［J］.Endocrinol，2003，144（5）：1770－1779.

［5］HARRIS R C，SODERLUND K，HULTMAN E.Elevation of creatine in resting and exercised muscle of normal subjects by creatine supplementation［J］.Clin Sci（Lond），1992，83（3）：367－374.

［6］HUNTER R W，TREEBAK J T，WOJTASZEWSKI J F，et al.Molecular mechanism by which AMP－activated protein kinase activation promotes glycogen accumulation in muscle［J］.Diabetes，2011，60（3）：766－774.

［7］JORGENSEN S B，NIELSEN J N，BIRK J B，et al.The alpha2－5＇AMP－activated protein kinase is a site 2glycogen synthase kinase in skeletal muscle and is responsive to glucose loading［J］.Diabetes，2004，53（12）：3074－3081.

［8］MATTHEWS R T，YANG L，JENKINS B G，et al.Neuroprotective effects of creatine and cyclocreatine in animal models of Huntington＇s disease［J］.J Neurosci，1998，18（1）：156－163.

［9］OP＇EB，RICHTER E A，HENQUIN J C，et al.Effect of creatine supplementation on creatine and glycogen content in rat skeletal muscle［J］.Acta Physiol Scand，2001，171（2）：169－176.

［10］OP＇EB，URSO B，RICHTER EA，et al.Effect of oral creatine supplementation on human muscle GLUT4protein content after immobilization［J］.Diabetes，2001，50（1）：18－23.

［11］PONTICOS M，LU Q L，MORGAN J E，et al.Dual regulation of the AMP－activated protein kinase provides a novel mechanism for the control of creatine kinase in skeletal muscle［J］.EMBO J，1998，17（6）：1688－1699.

［12］ROBINSON T M，SEWELL D A，HULTMAN E，et al.Role of submaximal exercise in promoting creatine and glycogen accumulation in human skeletal muscle［J］.J Appl Physiol，1999，87（2）：598－604.

［13］ROONEY K，BRYSON J，PHUYAL J，et al.Creatine supplementation alters insulin secretion and glucose homeostasis in vivo［J］.Metabolism，2002，51（4）：518－522.

［14］YOUNG J C，YOUNG R E.The effect of creatine supplementation on glucose uptake in rat skeletal muscle［J］.Life Sci，2002，71（15）：1731－1737.

The Effect of 2mM Creatine Incubation and Electrical Stimulation on the Path of Glycogen Synthesis of C2C12Myotube

ZHAO Jun12，XU Xiao－yang1，LIN Wen－tao3，ZHOU Zhou1

Objective：To investigate the possible mechanism of increment of skeletal muscle glycogen by creatine.Method：Through the cell model of cultivated C2C12and electrical－stimulated C2C12，this paper investigated the effect of creatine and electricity on the glycogen synthesis of C2C12and the expression of the related genes such as AMPKα1，HKII and GS－I.Result：The supplementation of creatine could increase the glycogen synthesis of electrical－stimulated C2C12，and the main mechanism is positive effect of stimulated of AMPKα1，after the path of glycogen synthesis is stimulated.However，2mM creatine restrains the gene expression of HKII and GS－I of electrical－stimulated C2C12to maintain the cell homeostasis.Conclusion：The cell experiment suggests that creatine supplementation can increase the synthesis and content of muscle glycogen，so enhance the ability of exercise.

C2C12myotube；creatine；muscleglycogen；AMPKα1mRNA；HKIImRNA；GS－I mRNA

G804.7

A

1000－677X（2011）09－0063－06

2011－07－11；

2011－08－28

趙軍（1971－），男，湖北宜昌人，副教授，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)，Tel：（020）85220282，E－mail：tzhaojun＠jnu.edu.cn。

1.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006；2.暨南大學(xué)體育部，廣東廣州510632；3.廣州體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)生化省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510500

1.South China Normal University，Guangzhou 510006，China；2.Jinan University，Guangzhou 510632，China；3.Guangzhou Sport College，Guangzhou 510500，China.