張永亮，武安泉，盛東峰，張 杰

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河南 周口 466001）

野桑蠶漆酶基因克隆、序列分析及轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜研究

張永亮＊，武安泉，盛東峰，張 杰

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河南 周口 466001）

利用RT－PCR方法，克隆了野桑蠶Bombyx mandarina漆酶基因，獲得了其cDNA序列.該序列長(zhǎng)2 317bp，含有一個(gè)2 295bp的完整開(kāi)放閱讀框，有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，編碼一個(gè)由764個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)分別為84 340.91和6.61.推導(dǎo)的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲（Laccase）基因相應(yīng)氨基酸序列有較高的同源性，該序列具有它們的漆酶基因所共有的典型特征.組織特異性表達(dá)分析表明了該基因僅在野桑蠶的表皮、頭部、中腸和血液中有表達(dá).這些結(jié)果為進(jìn)一步研究野桑蠶漆酶基因的功能提供了分子基礎(chǔ).

野桑蠶；漆酶基因克??；序列分析；轉(zhuǎn)錄表達(dá)

漆酶（Laccase）是一種含銅離子結(jié)合位點(diǎn)的多酚氧化酶，能夠催化酚類物質(zhì)氧化形成醌，將氧還原成水，醌和自由基產(chǎn)物一起經(jīng)過(guò)非酶促耦合反應(yīng)生產(chǎn)黑色素［1-2］.它廣泛存在于生物體內(nèi)，人們已從植物、細(xì)菌和真菌等中提取了漆酶，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及功能進(jìn)行了研究［3-11］，但對(duì)昆蟲漆酶的研究報(bào)道極少.漆酶主要參與昆蟲表皮的硬化過(guò)程，對(duì)昆蟲的成活至關(guān)重要［12］.迄今尚未見(jiàn)有關(guān)野桑蠶漆酶基因的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)野桑蠶漆酶基因的克隆、序列分析及轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜研究，旨在為進(jìn)一步了解該基因的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野桑蠶采集自重慶市北碚區(qū)家蠶飼養(yǎng)場(chǎng).

1.2 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

實(shí)驗(yàn)材料采集后，提取各組織器官，超低溫冷凍保存?zhèn)溆?用Trizol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品）提取野桑蠶5齡幼蟲第3天各組織的總RNA，所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行.cDNA第1鏈按cDNA合成試劑盒的操作方法，在M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司產(chǎn)品）的作用下合成.實(shí)驗(yàn)所用的各組織器官如下：野桑蠶5齡幼蟲第3天的中腸、頭部、卵巢、精巢、絲腺、血液、脂肪體、表皮、馬氏管.

1.3 野桑蠶漆酶基因的分子克隆及DNA測(cè)序

根據(jù)登錄在基因庫(kù)上家蠶漆酶基因開(kāi)放閱讀框的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，用于擴(kuò)增野桑蠶漆酶基因開(kāi)放閱讀框序列.正向引物序列：5′TGTGTGTTAACATGGGGTGCA 3′；反向引物序列：5′CTAGGAACCGTTCAGTGGAGT 3′.PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，然后94℃循環(huán)變性0.5min、55℃退火0.5min、72℃延伸3min，共30個(gè)循環(huán)，再72℃終延伸10min.取來(lái)自表皮的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，按膠回收試劑盒（華舜公司產(chǎn)品）說(shuō)明進(jìn)行回收.將回收純化后的產(chǎn)物與pMD18－T載體（Takara公司產(chǎn)品）連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株后，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司測(cè)序.

1.4 核苷酸和氨基酸的序列分析

用PHRAP軟件（http：／／www.phrap.org）對(duì)得到的cDNA序列拼接成完整的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)序列.利用ExPaSy工具（http：／／www.expasy.org／tools／dna.html）將完整開(kāi)放閱讀框的cDNA序列翻譯成其相應(yīng)的氨基酸序列.用Clustal X［13］將野桑蠶的氨基酸序列與其它昆蟲的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，在SMART（http：／／smart.emblheidelberg.de／）網(wǎng)站預(yù)測(cè)其功能域.在http：／／au.expasy.org／tools／網(wǎng)站預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子 量，用 http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html軟件計(jì)算其疏水性.

1.5 野桑蠶漆酶基因RT－PCR表達(dá)模式分析

根據(jù)已獲得的野桑蠶漆酶基因保守序列的cDNA片段設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，用于RT－PCR檢測(cè)野桑蠶漆酶基因的表達(dá)模式.正向引物為：5′GTAATGCTGGCACTCACTTCT 3′；反 向 引 物為：5′TGGTAAGGTCCTCTAGCGTAT 3′.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，然后94℃循環(huán)變性0.5min、55℃退火0.5min、72℃延伸1min，25個(gè)循環(huán).最后再72℃終延伸10min.根據(jù)家蠶Actin3基因全序列，設(shè)計(jì)2個(gè)半定量?jī)?nèi)標(biāo)基因的引 物：P1 5′－CATGAAGATCCTCACCGAGCG－3′；P2 5′－CGTAGCACAGCTTCTCCTTGATA－3′.PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同上，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

圖1 野桑蠶漆酶基因部分cDNA片段凝膠電泳圖1泳道：RT－PCR擴(kuò)增得到的片段；M：DL4500markerFig.1 Agarose gel analysis of Bombyx mandarina laccase partial cDNA fragments amplified by RT－PCR

2.1 野桑蠶漆酶基因的分子克隆及核苷酸序列分析

以野桑蠶5齡幼蟲第3天表皮組織的cDNA為模板，用RT－PCR的方法對(duì)野桑蠶漆酶基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得了長(zhǎng)約2 317bp的片段（見(jiàn)圖1），該片段含有2 295bp的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)序列.完整開(kāi)放閱讀框的位置在12～2 306bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA，編碼764個(gè)氨基酸殘基.功能域預(yù)測(cè)表明該開(kāi)放閱讀框含有1個(gè)保守的信號(hào)肽序列，位于圖2中的1～23氨基酸殘基處，曲線標(biāo)明；3個(gè)公認(rèn)的高度保守的銅氧化酶功能域結(jié)構(gòu)序列，分別位于圖2中的200～314、327～480及581～742氨基酸殘基處，下劃線標(biāo)明.使用BLAST程序?qū)⑵崦富虻腸DNA序列與家蠶基因組序列比對(duì)，結(jié)果顯示該基因有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，并且外顯子和內(nèi)含子邊界符合GU－AG規(guī)則.預(yù)測(cè)該蛋白酶的分子量和等電點(diǎn)分別為84340.91和6.61，氨基酸序列的C－末端有疏水跨膜區(qū)域.

2.2 野桑蠶漆酶氨基酸序列分析

昆蟲體內(nèi)的漆酶具有不同的亞型，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)分析表明漆酶基因不同亞型之間有不同程度的一致性，本研究的野桑蠶漆酶基因的氨基酸序列與其他昆蟲Laccase2基因相應(yīng)的氨基酸序列同源性較高，而與其Laccase1的同源性較低.如與煙草天蛾Laccase2和Laccase1（蛋白質(zhì)序列號(hào)分別為AAN17507.1 和 AAN17506.1）的一致性分別為93%、38%；與家蠶Laccase2和Laccase1（蛋白質(zhì)序列號(hào)分別為NP 001103395.1和 DAA06286.1）的一致性分別為99%、39%；與樺尺蠖Laccase2（蛋白質(zhì)序列號(hào)為AEP43806.1）的一致性為95%；與赤擬谷盜Laccase2和Laccase1（蛋白質(zhì)序列號(hào)分別為NP 001034487.2和 NP 001034514.1）的一致性分別為75%、38%；與西方蜜蜂Laccase2（蛋白質(zhì)序列號(hào)為ACK57559.2）的一致性為81%；與松墨天牛Laccase2（蛋白質(zhì)序列號(hào)為 ABU68466.1）的一致性為74%；與岡比亞按蚊Laccase2A、Laccase2B、Laccase3（蛋白質(zhì)序列號(hào)分別為 AAX49501.1、AAX49502.1、ABQ95972.2）的一致性分別為77%、74%和41%.

圖2 野桑蠶漆酶基因的cDNA序列及其翻譯的蛋白質(zhì)序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of Bombyx mandarina laccase gene The amino acid sequence is given below the nucleic acid sequence

2.3 野桑蠶漆酶基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜

通過(guò)RT－PCR檢測(cè)了漆酶基因在野桑蠶不同組織器官中的表達(dá)情況，結(jié)果表明該基因在表皮、頭部和中腸均具有較高豐度的表達(dá)，在血液中僅有微弱的表達(dá)，而在其他組織器官中均未檢測(cè)到表達(dá)（見(jiàn)圖3）.

圖3 野桑蠶漆酶基因在不同組織器官中的表達(dá)譜Fig.3 Expression profile of B.mandarina laccase gene in different tissues and organs of 5th instar

3 討論

利用RT－PCR的方法獲得了野桑蠶Laccase基因完整開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)cDNA序列.大多數(shù)昆蟲包括煙草天蛾、家蠶、岡比亞按蚊和赤擬谷盜等的Laccase基因都有2個(gè)亞型（Laccase1和Laccase2）或更多、3個(gè)高度保守的銅氧化酶結(jié)合位點(diǎn)、有信號(hào)肽序列，本研究取得了相似的結(jié)果.同源性分析表明本文獲得的野桑蠶Laccase氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲Laccase2氨基酸序列的一致性較高（74% ～99%），與家蠶Laccase2氨基酸序列的一致性最高（99%），表明本研究得到的野桑蠶Laccase基因可能為L(zhǎng)accase2.在野桑蠶中是否也存在Laccase1基因或更多的亞型還有待進(jìn)一步研究.此外，如上所述野桑蠶Laccase和家蠶Laccase2高度同源的事實(shí)進(jìn)一步支持了家蠶起源于野桑蠶，家蠶是由野桑蠶進(jìn)化而來(lái)的結(jié)論.

RT－PCR分析表明了野桑蠶Laccase的表達(dá)模式和其他昆蟲具有一定的相似性，如Laccase mRNA在岡比亞按蚊的中腸、表皮及其幼蟲、蛹和成蟲期［14］，家 蠶 的 表 皮［15］，松 墨 天 牛 的 表 皮［16］，甲蟲的預(yù)化蛹、蛹及成蟲發(fā)育階段［17］，煙草天蛾的預(yù)化蛹和0～3h蛹表皮［18］等均有表達(dá)，且表皮的表達(dá)量最高.這些研究結(jié)果進(jìn)一步印證了漆酶在昆蟲表皮的硬化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用的結(jié)論.研究結(jié)果還提示了對(duì)于不同的物種，漆酶的組織表達(dá)可能存在一定的差異.推測(cè)不同組織或不同物種的漆酶可能具有不同的生理功能.

漆酶在昆蟲的表皮硬化和對(duì)病原體及寄生蟲的防御反應(yīng)中起著重要作用，然而表皮硬化和防御反應(yīng)對(duì)昆蟲的成活至關(guān)重要［12］.因此，野桑蠶漆酶基因的分子克隆和表達(dá)譜分析為其功能研究、生物防治及家蠶的起源和進(jìn)化等提供了分子基礎(chǔ).

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Cloning，sequence analysis and transcriptional expression profiles of Bombyx mandarina Laccase gene

ZHANG Yongliang，WU Anquan，SHENG Dongfeng，ZHANG Jie
（Department of Life Science，Zhoukou Normal University，Zhoukou，Henan 466001）

The complemental deoxyribonucleic acid（cDNA）of Bombyx mandarina Laccase gene was cloned by reverse transcription－polymerase chain reaction（RT－PCR）.The results showed that the cDNA with 2 317bp in length contained an open reading frame（ORF）of 2 295bp which encoded 764amino acid residues，contains 8exons and 7introns，and a predicted molecular weight of 84340.91and isoelectric point of 6.61.The deduced amino acid sequence had a high identity to the reported sequence of laccase2 from other lepidopterous insects and shared the typical structural features of laccase from other insects.The Laccase was only expressed in epidermis，head，midgut，and blood of B.mandarina by RT－PCR analysis.These results provide molecular basis for further studying the function of Laccase gene in B.mandarina.

Bombyx mandarina；Laccase gene cloning；sequence analysis；transcriptional expression

Q812

A

1000－1190（2012）04－0468－05

2012－03－10.

河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010A230016）；周口師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目；周口師范學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目.

＊E－mail：zylxndx＠163.com.