于姍姍，王青林，孟憲亮，董云偉，董雙林

（1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島266003；2.廈門大學海洋與環(huán)境學院，福建廈門361005）

鹽度驟變對仿刺參hsp70及hsp90基因表達的影響＊

于姍姍1，王青林1，孟憲亮1，董云偉2＊＊，董雙林1

（1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島266003；2.廈門大學海洋與環(huán)境學院，福建廈門361005）

為研究夏季暴雨導致的養(yǎng)殖池塘鹽度變化對仿刺參（Apostichopus japonicus）生理的影響，在實驗室內(nèi)模擬野外鹽度變化，采用半定量RT－PCR的方法研究了其hsp70、hsp90a及hsp90b基因的表達。實驗中，鹽度先以每6 h降2.5的速度由30降至20；保持96 h后，再以同樣的速度由20升至30，隨后在鹽度為30條件下保持96 h。在鹽度變化過程中隨機取樣。hsp70和hsp90b基因在鹽度降至20后表達量開始顯著升高（P＜0.05），hsp90a基因在鹽度降至22.5時表達量開始顯著升高（P＜0.05）；但保持在鹽度為20條件下，3個基因的表達量均逐漸降低至初始值。在之后的鹽度升高及恢復階段，3個基因表達量均有先升高后降低的趨勢，表明hsp70、hsp90a和hsp90b基因是仿刺參在鹽度脅迫下的重要響應(yīng)因子。

仿刺參；鹽度；熱休克蛋白

作為最重要的生態(tài)因子之一，鹽度對仿刺參的行為、生長、繁殖有著直接的影響［1－3］。目前蝦池養(yǎng)殖已經(jīng)成為仿刺參養(yǎng)殖的重要模式［4－5］。在蝦池養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖池塘水體交換由自然潮汐決定，一般情況下鹽度會維持在相對穩(wěn)定的范圍，但在夏季暴雨過后鹽度會驟降至20左右，并維持數(shù)天［6］。這種大范圍的鹽度變化，必然會對仿刺參帶來消極的影響，嚴重時會導致仿刺參的大規(guī)模死亡，給仿刺參養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。有研究表明仿刺參適宜生長的鹽度為20～35，最適生長鹽度為25～30［7］。鹽度驟降會引起體腔液滲透壓的改變從而產(chǎn)生滲透壓脅迫，滲透壓脅迫使細胞內(nèi)離子代謝受到嚴重影響，進一步導致蛋白合成紊亂以及蛋白損傷［8－9］。因此，研究仿刺參對鹽度變化的反應(yīng)，對探討不同鹽度下仿刺參的生長及實際生產(chǎn)應(yīng)用具有一定的指導意義。

前期研究表明，仿刺參在滲透壓脅迫下，其熱休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）會隨即被誘導產(chǎn)生［10］。熱休克蛋白是一組具有重要生理功能、結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白質(zhì)，在熱脅迫、組織缺氧、滲透壓脅迫、重金屬污染等脅迫條件下都會大量產(chǎn)生。作為分子伴侶，Hsp參與細胞中變性蛋白的重折疊，防止變性蛋白被降解［11－14］。Hsp70是Hsp家族的重要成員在調(diào)節(jié)環(huán)境脅迫的影響以及維持細胞內(nèi)動態(tài)平衡過程中發(fā)揮了重要作用［15－17］。Hsp90也是Hsp家族的重要成員，是蛋白質(zhì)成熟過程中的分子伴侶，在維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，參與細胞周期調(diào)節(jié)，機體免疫和信號傳導等過程中發(fā)揮重要作用［18－19］。之前的研究表明，Hsp70家族在仿刺參應(yīng)對滲透壓脅迫以及熱脅迫過程中能發(fā)揮重要作用［10，20－21］，但有關(guān)Hsp90對鹽度脅迫響應(yīng)的研究很少。因此本實驗?zāi)M自然環(huán)境中鹽度變化模式，選擇hsp70、hsp90a及hsp90b3條基因（其中hsp90a與hsp90b分別是2條序列不同的hsp90基因），進一步研究鹽度驟變對hsp70及hsp90基因表達的影響，豐富仿刺參生理生態(tài)學理論，為保障仿刺參養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗所需仿刺參（Apostichopus japonicus）幼參采自山東省即墨市育苗場，平均體重為（0.43±0.11）g。由于夏季青島養(yǎng)殖池塘的水溫約為25℃，本實驗選定25℃作為實驗溫度。購買的仿刺參轉(zhuǎn)移至水槽后，以1℃·d－1逐漸升溫至25℃。之后25℃暫養(yǎng)2周。

暫養(yǎng)期間不間斷充氣，光照周期為14 L∶10 D。水源為沙濾自然海水，每天換水1／2，海水鹽度為30左右。換水前對海水進行預(yù)加熱，防止換水造成水族箱溫度變化過大。每天16：00按仿刺參體重的5%投喂青島七好飼料有限公司生產(chǎn)的仿刺參配合飼料，組成為：粗蛋白（22.9±0.2）%、粗脂肪（2.1±0.0）%、灰分（34.7±0.6）%，含水量（9.0±0.0）%，能值（10.6±0.0）kJ·g－1。

1.1.2 酶和試劑 總RNA提取試劑盒購買自Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購買自美國promega公司；半定量PCR Taq酶、Marker等購買自廣州東盛科技有限公司，引物由華大基因合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽度變化 如圖1所示，鹽度變化共分4個階段，第一階段鹽度由30降至20，每6 h降低2.5（J1、J2、J3分別表示鹽度降至27.5、25、22.5后6 h）；第二階段鹽度在20水平上維持96 h（V1～V8分別表示鹽度降至20后1、3、6、12、24、48、72及96 h）；第三階段鹽度由20升至30，每6 h升高2.5（S1、S2、S3分別表示鹽度升至22.5、25、27.5后6 h）。第四階段鹽度30、維持96 h（N1～N8分別表示鹽度升至30后1、3、6、12、24、48、72及96 h）。在圖1所示，在各取樣時點各隨機取5頭仿刺參，迅速解剖并取其體壁組織保存于－80℃超低溫冰箱中。

圖1 鹽度變化模式圖Fig.1 Diagram of the salinity change mode of experimental treatment

1.2.2 引物設(shè)計 本實驗選取的3條基因hsp70，hsp90a和hsp90b，是從NCBI仿刺參cDNA文庫中篩選的（Ajhsp70，GH985449；Aj90a，JF907619；Aj90b，GH550976）。引物設(shè)計使用軟件Primer 5.0，實驗中使用的引物見表1。將仿刺參的部分β－actin序列（312bp）作為內(nèi)參，其引物序列來自Meng et al.［21］。

表1 仿刺參hsp基因表達所用的引物Table 1 Primer sets designed for semi－quantitative RT－PCR analysis of hsps mRNA in sea cucumber Apostichopus japonicus.

1.2.3 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 仿刺參體壁組織總RNA的提取按照Trizol試劑盒說明書進行，cDNA第一鏈利用Oligo d T18作為引物合成。合成的第一鏈c DNA通過持家基因β－actin的半定量PCR檢驗其是否可用［21］。

1.2.4 hsp70，hsp90a及hsp90b半定量RT－PCR在半定量RT－PCR過程中使用等量的c DNA模板，PCR反應(yīng)條件均已優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系25μL，包括：2.5μL 10×PCR buffer，1.6μL MgCl2（25 mmol·L－1），2.0μL d NTPs（2.5 mmol·L－1），各1μL的上下游引物（10 pmol·m L－1），15.875μL滅菌水，0.125μL（5U·μL－1）Taq DNA聚合酶，以及1μL cDNA模板。RT－PCR反應(yīng)程序如下：94℃5 min；接著是30個循環(huán)（hsp70、hsp90a及hsp90b）或28個循環(huán)（βactin）：94℃45 s，53℃（hsp70、hsp90a及hsp90b）或55℃（β－actin）45 s，72℃1 min；最后72℃延伸10 min。RT－PCR產(chǎn)物使用EB染色的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，為了確保RT－PCR反應(yīng)的特異性，產(chǎn)物進行膠回收并測序。電泳圖使用Gene Tools軟件分析，基因表達量通過其電泳圖中光密度值與內(nèi)參基因光密度值的比值表示（Chsp70／Cβ－actin，Chsp90a／Cβ－actinor Chsp90b／Cβ－actin）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS13.0進行，各個基因不同取樣點基因表達量的差異采用單因子方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05作為差異顯著的標準。

2 結(jié)果

2.1 鹽度變化對仿刺參hsp70基因表達的影響

圖2為仿刺參hsp70基因的表達結(jié)果，可見在鹽度由正常海水的30降至20過程中，hsp70基因的表達量逐漸升高，并在鹽度降至20后1 h（V1）出現(xiàn)最大值（Chsp70／Cβ－actin＝0.758 4，約為對照組的2.4倍）。在20鹽度下維持12 h后，hsp70基因表達量顯著下降（P＜0.05，Chsp70／Cβ－actin＝0.455 2）。V8即表示96 h時表達量降至最低（Chsp70／Cβ－actin＝0.364 7）。從S1點起鹽度逐漸升高，hsp70基因表達量也逐漸升高，在S3點、即鹽度升至27.5后的6 h表達量達到最大值（Chsp70／Cβ－actin＝0.690 1，約為對照組的2.2倍）；S3和鹽度恢復30后1 h的N1，其hsp70基因表達量均顯著高于初始點C（P＜0.05）。N2點為鹽度恢復30后3 h的hsp70基因表達量，可見出現(xiàn)了明顯的下降并在之后繼續(xù)下降至接近初始點C。

圖2 鹽度變化對仿刺參hsp70基因表達的影響Fig.2 Levels of hsp70 in sea cucumbers Apostichopus japonicus during the salinity change

2.2 仿刺參hsp90s基因表達結(jié)果

仿刺參hsp90a、hsp90b基因表達量的變化趨勢與hsp70基因相似（見圖3）。如圖3 A所示，hsp90a基因表達量在J3、即鹽度降至22.5的6 h后顯著增加（P＜0.05，Chsp90a／Cβ－actin＝0.788 8），在降至20的1 h后出現(xiàn)最大值（Chsp90a／Cβ－actin＝1.182，約為對照組的3.3倍），之后表達量逐漸下降；V3點即維持20鹽度6 h后的表達量開始顯著下降（P＜0.05，Chsp90a／Cβ－actin＝0.836 6），20鹽度96 h后表達量降至最低、并接近初始值（Chsp90a／Cβ－actin＝0.454 3）；S1點開始鹽度逐漸升高，hsp90a基因表達量也隨之逐漸升高，在S3點鹽度升至27.5后6 h表達量顯著增加（P＜0.05，Chsp90a／Cβ－actin＝0.819 1，約為對照組的2.3倍），維持恒定鹽度6 h后表達量出現(xiàn)了明顯的下降，并在96 h降至接近初始值。在J3、V1、V2、V3、V4（鹽度22.5、鹽度降至20后1、3、6和12 h）以及S 3、N 1、N 2（鹽度27.5、鹽度恢復30后1和3 h）點的表達量顯著高于初始點C。

如圖3 B所示，hsp90b基因的表達量在V1點、即鹽度降至20的1 h后顯著增加并達到最大值（Chsp90b／Cβ－actin＝1.33 5，約為對照組的2.5倍），之后表達量逐漸下降；V4點、即維持20鹽度12 h后表達量開始顯著下降（P＜0.05，Chsp90b／Cβ－actin＝0.779 1）。20鹽度96 h后表達量降至最低并接近初始值（Chsp90b／Cβ－actin＝0.572 1）；從S1點開始鹽度逐漸升高，hsp90b基因表達量也隨之逐漸升高，在S3點鹽度升至27.5后6 h表達量顯著增加（P＜0.05，Chsp90b／Cβ－actin＝0.991 8，約為對照組的2.2倍），之后表達量逐漸下降，并在96 h降至接近初始值；hsp90b在V1、V2、V3（鹽度降至20后的1、3和6）以及鹽度27.5的S3點的表達量顯著高于初始點C。

圖3 鹽度變化對仿刺參（A）hsp90a，（B）hsp90b基因表達的影響Fig.3 Levels of（A）hsp90a，（B）hsp90b in sea cucumbers Apostichopus japonicus during the salinity change

3 討論

3.1 鹽度驟變對仿刺參的消極影響

鹽度作為水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中重要的理化因子，與養(yǎng)殖動物的生長、發(fā)育、繁殖等行為密切相關(guān)。實踐表明，鹽度的驟降會引起海參大規(guī)模的死亡［10，22－23］。夏季雨水較多，降水增加導致養(yǎng)殖池塘的鹽度大幅變化。2005年呂偉志等監(jiān)測了丹東椅圈鎮(zhèn)仿刺參養(yǎng)殖池塘的鹽度，發(fā)現(xiàn)在暴雨影響下海參養(yǎng)殖池水的鹽度在十幾個小時內(nèi)從30驟降到20以下，且低至16的鹽度持續(xù)了一個多月，個別被淡水淹沒的池塘甚至不足10［24］。這種快速且大幅的鹽度變化超出了海參對鹽度的正常適應(yīng)范圍，常常會造成仿刺參大量發(fā)病、死亡，給仿刺參養(yǎng)殖帶來極大的威脅和經(jīng)濟損失［6］。

3.2 鹽度脅迫對仿刺參hsp基因表達的影響

熱休克蛋白常被認為是生物體對環(huán)境脅迫響應(yīng)的標志物［14］。在本實驗中，當鹽度降至20 6 h后hsp70、hsp90a以及hsp90b基因的表達量均顯著高于初始值（P＜0.05），說明鹽度20已顯著低于仿刺參適宜鹽度，并引起生物機體內(nèi)相應(yīng)生理生化變化。鹽度脅迫會對細胞內(nèi)離子調(diào)控產(chǎn)生不利的影響，hsp基因隨即誘導表達，指導熱休克蛋白（Hsps）合成，參與細胞功能修復［8，14，25－26］。hsp基因轉(zhuǎn)錄與翻譯以及參與細胞內(nèi)生化反應(yīng)是個耗能的過程。因此，長期處于這種脅迫條件下必然會導致海參的生長不良，從而影響幼參的生長。王吉橋等指出，鹽度為26時幼參的生長速度比鹽度33時減少了62.5%，而鹽度22的處理組中幼參出現(xiàn)了負增長［27］。袁秀堂等人認為，當外界鹽度與仿刺參體液等滲透點鹽度31.5一致時，仿刺參的能量消耗最低，生物能轉(zhuǎn)化效率較高［28］。

3.3 hsp基因表達的時序性

hsp基因的表達具有時序性，Dong等［29］以及Meng等［30］發(fā)現(xiàn)仿刺參熱激72 h后Hsp70表達量降至初始值。在本實驗中hsp70、hsp90a及hsp90b基因均出現(xiàn)了時序性表達，在鹽度下降后基因表達量顯著升高（P＜0.05），隨后表達量又逐漸下降至初始水平，其中hsp70、hsp90b基因表達量在低鹽條件下6 h仍可保持較高水平，但在12 h時表達量顯著下降（P＜0.05）；hsp90a基因表達量在低鹽條件下3 h仍保持較高水平，但在6 h時顯著下降（P＜0.05）。在鹽度由20升至30的過程中hsp70、hsp90a及hsp90b基因表達量再次顯著升高（P＜0.05），隨后表達量再次下降，其中hsp70、hsp90b基因表達量在鹽度維持在30的3 h后仍保持較高水平，但在6 h時表達量出現(xiàn)明顯下降。hsp90a基因表達量在鹽度維持在30的6 h仍保持較高水平，但在12 h時開始出現(xiàn)明顯下降。在第二次鹽度驟變（即由20升至30）過程中，hsp70、hsp90a和hsp90b基因的表達量相對于第一次鹽度驟變（即由30降至20）要低，并且表達量在高水平維持的時間較短，即表達量下降較快，推測可能是由于經(jīng)歷96h的低鹽處理，仿刺參長時間處于不適宜的生存環(huán)境，影響了其體內(nèi)生理生化反應(yīng)，使其代謝率降低，在這種較低代謝的情況下無法提供足夠的能量用于合成熱休克蛋白。也有可能是鹽度30在仿刺參適宜范圍內(nèi)，仿刺參體內(nèi)蛋白變性減少，因此hsp基因上調(diào)表達低于降鹽過程。

本實驗的結(jié)果表明，鹽度驟降可引起熱休克蛋白表達的上調(diào)，在較長時間的低鹽度脅迫過后，仿刺參無法產(chǎn)生足夠的熱休克蛋白用于細胞修復，降低了仿刺參對脅迫條件的耐受能力，從而進一步影響仿刺參的生存。因此在實際生產(chǎn)實踐中，在持續(xù)下雨或暴雨過后應(yīng)及時換水或?qū)︷B(yǎng)殖池塘進行投鹽，以盡快恢復適宜鹽度。此外，目前的研究表明多種環(huán)境脅迫可誘導仿刺參hsp70基因的表達［10，20，29］，在本實驗中hsp90a及hsp90b基因在鹽度脅迫條件下表達量也表現(xiàn)出了與hsp70基因相似的趨勢，可推斷hsp90基因的上調(diào)表達是仿刺參對環(huán)境脅迫的生理適應(yīng)機制之一。

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Effects of Salinity Fluctuation on the Expression of hsp 70 and hsp90s Genes in Sea Cucumber，Apostichopus japonicus Selenka

YU Shan－Shan1，WANG Qing－Lin1，MENG Xian－Liang1，DONG Yun－Wei2，DONG Shuang－Lin1
（1.The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，F(xiàn)isheries College，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.College of Oceanography，Xiamen University，Xiamen 361005，China）

The expression of hsp70，hsp90a and hsp90b genes in sea cucumber（apostichopus japonicus Selenka）were studied in a simulated field salinity decrease after a heavy rainfall in summer.Salinity firstly decreased gradually from 30 to 20 at a rate of 2.5 every 6 h，and then was maintained at 20.After 96 h at the low salinity（20），salinity was increased gradually to 30 at a rate of 2.5 every 6 h，and then was maintained at 30 for 96 h.Results showed that expressions of hsp70，hsp90a and hsp90b genes all increased after salinity decrease，led to the maximum levels at the lowest salinity，and then dropped to the original level after 72 h at low－salinity exposure.Similarly，the expression of these three genes in sea cucumber increased with the salinity increase，and decreased to the original level after 72 h at low－salinity exposure.Compared to the second salinity fluctuation，the gene expressions were lower than those of the first salinity fluctuation，which might be caused by energy budget.In this study the expression of hsp90a and hsp90b genes was similar to hsp70 gene’s expression，and the upregulated expression of hsp90s also could be regarded as the physiologic adaptation of Apostichopus japonicus to environmental stresses.

Apostichopus japonicus；salinity；heat shock protein

S917.4

A

1672－5174（2012）09－022－06

國家自然科學基金項目（30400333）；國家科技支撐計劃項目（2006BAD09A01）；山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金計劃項目（BS2009NY019）資助

2011－09－11；

2012－02－07

于姍姍（1987－），女，碩士生。E－mail：heiseyoumoys＠gmail.com

＊＊通訊作者：E－mail：dongyw＠xmu.edu.cn

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