王志軍，梁瑞瑞，雷海英

（1.長(zhǎng)治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長(zhǎng)治046011； 2.長(zhǎng)治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長(zhǎng)治046011）

肌醇與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究

王志軍1＊，梁瑞瑞1，雷海英2

（1.長(zhǎng)治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長(zhǎng)治046011； 2.長(zhǎng)治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長(zhǎng)治046011）

應(yīng)用熒光光譜研究了肌醇與牛血清白蛋白（BSA）分子間的相互作用；求出了猝滅常數(shù)，討論了肌醇對(duì)BSA構(gòu)象的影響，并依據(jù)能量轉(zhuǎn)移理論確定了肌醇與蛋白的最近距離.結(jié)果表明，肌醇與BSA兩者間的相互作用為單一的動(dòng)態(tài)猝滅過程.

肌醇；牛血清白蛋白；相互作用；熒光光譜

血清白蛋白是血漿中最豐富的載體蛋白，它能與許多內(nèi)源和外源性化合物結(jié)合，起到存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[1].肌醇，又稱為環(huán)己六醇（結(jié)構(gòu)式見圖1），是維生素B族中的一種.肌醇和膽堿一樣是親脂肪性的維生素，它有9種立體異構(gòu)體，其中有醫(yī)用價(jià)值的內(nèi)消旋體，可促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、助長(zhǎng)發(fā)育、增進(jìn)食欲，用于治療肝脂肪過多癥、肝炎、肝硬化癥等[2].有關(guān)肌醇與血清白蛋白相互作用的研究尚未見報(bào)道.作者利用熒光光譜研究肌醇與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用.

圖1 肌醇的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of inositol

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F－4600熒光分光光度計(jì)（日本日立公司），U－3900紫外分光光度計(jì)（日本日立公司），電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），牛血清白蛋白（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），肌醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；水為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確移取1.0mL用pH ＝7.4Tris－HCl緩沖溶液配置好的BSA溶液（1.0×10－6mol/L）于比色皿中，固定熒光激發(fā)波長(zhǎng)為290nm，掃描其熒光光譜，所用液池為1cm石英池，入射狹縫為5.0nm，出射狹縫為1.0nm，此外分別設(shè)置Δλ＝60nm和Δλ＝15nm，掃描加入不同量肌醇時(shí)蛋白質(zhì)溶液的同步熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 肌醇與BSA相互作用的熒光光譜

肌醇自身存在很小的熒光，與BSA相比幾乎可以忽略.固定熒光激發(fā)波長(zhǎng)為290nm，25℃下的BSA熒光光譜圖以及在肌醇作用下的BSA熒光猝滅光譜圖見圖2.從圖2可以看出，固定BSA的量，向其中加入不同量的肌醇溶液，隨著肌醇量的增加，BSA在340nm處的熒光特征發(fā)射峰強(qiáng)度明顯降低，峰形無明顯變化，說明肌醇對(duì)BSA的熒光有猝滅作用，二者之間存在相互作用.

2.2 猝滅機(jī)理的確定和猝滅常數(shù)的測(cè)定

熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[3].靜態(tài)猝滅是因?yàn)殁鐒┓肿雍蜔晒馕镔|(zhì)分子間形成了非熒光性的復(fù)合物；動(dòng)態(tài)猝滅是因?yàn)殁鐒┓肿雍蜔晒馕镔|(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間相互碰撞而導(dǎo)致熒光猝滅.動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)隨著溫度升高而增強(qiáng)，靜態(tài)猝滅正好相反.假設(shè)該猝滅過程是動(dòng)態(tài)猝滅，應(yīng)符合Stern－Volmer方程[3－5]，即

式中，F(xiàn)0和F分別為不加入和加入肌醇時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度.

根據(jù)不同溫度下的熒光猝滅圖（圖3），按式（1）可以求出3個(gè)溫度下的KSV，數(shù)據(jù)見表1，從中可以看出猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大，由此結(jié)果可知，肌醇猝滅BSA熒光的過程是動(dòng)態(tài)猝滅過程.

圖2 肌醇－BSA的熒光猝滅光譜圖Fig.2 Fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of inositol

圖3 肌醇對(duì)BSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線Fig.3 Stern－Volmer curves of BSA quenched by inositol

表1 肌醇與BSA結(jié)合的Stern－Volmer方程及常數(shù)Table 1 Stern－volmer quenching constants at different temperature

2.3 肌醇與BSA的結(jié)合距離

F?rster偶極－偶極無輻射能量轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為：供體能發(fā)熒光，供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有足夠的重疊，供體與受體足夠接近，且最大距離不超過7nm時(shí)，將發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致熒光體的熒光猝滅現(xiàn)象.因此，可以求得小分子與蛋白質(zhì)大分子的結(jié)合位置相對(duì)于發(fā)射熒光的基團(tuán)之間的距離r和能量轉(zhuǎn)移效率E.根據(jù)此理論，非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E、供體與受體之間的結(jié)合距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間有下列關(guān)系[6]：

式中：F和F0分別為存在和不存在受體時(shí)供體的熒光發(fā)射強(qiáng)度；K2為供體－受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的取向因子，取平均值2/3；N為介質(zhì)的折射指數(shù)，取水和有機(jī)物平均值1.336；φ為供體的熒光量子產(chǎn)率，取0.118；J為供體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分；Fλ為供體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；ελ為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù).

圖4 BSA的熒光光譜（a）和肌醇的吸收光譜（b）Fig.4 Fluorescence emission spectrum of BSA （a）and absorption spectrum of inositol（b）

293K下，在300～500nm波段，肌醇的吸收光譜及BSA的熒光光譜見圖4.將圖4中光譜重疊部分積分，求得光譜的重疊積分J＝2.28×10－14cm3·L·mol－1，計(jì)算求得BSA體系的能量轉(zhuǎn)移效率E＝0.23，結(jié)合距離r＝4.9nm.

據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有足夠的重疊，且供體與受體之間的最大距離不超過7nm時(shí)，將會(huì)發(fā)射非輻射能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致供體熒光猝滅.所以，肌醇與牛血清白蛋白分子之間發(fā)生的是非輻射能量轉(zhuǎn)移.

2.4 肌醇對(duì)BSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜可以反映小分子對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響.對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜，當(dāng)Δλ＝15nm時(shí)只顯示酪氨酸殘基的光譜特征，而當(dāng)Δλ＝60nm時(shí)僅表現(xiàn)色氨酸殘基的光譜特征[7].因殘基的最大吸收波長(zhǎng)與其所處的環(huán)境的極性有關(guān)，故而由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化.若最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移，表明殘基所處環(huán)境的極性增加，藍(lán)移則疏水性增加.BSA的同步熒光光譜圖見圖5.由圖5可知，當(dāng)Δλ＝60nm時(shí)，色氨酸熒光顯著猝滅，而酪氨酸殘基發(fā)射的熒光猝滅不明顯，表明肌醇與牛血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基；酪氨酸殘基的發(fā)射波長(zhǎng)沒有改變，色氨酸殘基的發(fā)射波長(zhǎng)稍微有點(diǎn)藍(lán)移，說明形成的復(fù)合物使色氨酸的生色團(tuán)疏水結(jié)構(gòu)變緊密，肽鏈的伸展程度減少，疏水性增加[7]，因此，肌醇的結(jié)合使BSA構(gòu)象發(fā)生了一定的變化.

圖5 肌醇對(duì)BSA同步熒光光譜的影響Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of BSA quenched by inositol

3 結(jié)論

用熒光光譜探討了肌醇對(duì)牛血清白蛋白熒光猝滅的機(jī)理.研究結(jié)果表明，肌醇與牛血清白蛋白之間的相互作用屬于動(dòng)態(tài)猝滅.同步熒光光譜表明肌醇的加入增加了牛血清白蛋白內(nèi)部色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性.

[1]肖厚榮，盛良全，施春華，等.水楊酸與牛血清蛋白相互作用的熒光光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2004，24（1）：78－81.

[2]陳 威.肌醇[J].生物學(xué)通報(bào)，1997，32（10）：26.

[3]趙 芳，梁 慧，程 惠，等.大黃酸銅（Ⅱ）配合物與牛血清白蛋白的相互作用[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（6）：1277－1283.

[4]尚永輝，孫家娟，劉 靜.水飛薊素與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究[J].化學(xué)研究，2011，22（2）：1－3.

[5]丁 玲，李 曦，張超燦.磁性微球與牛血清白蛋白的相互作用[J].化學(xué)研究，2010，21（1）：19－22.

[6]楊曼曼，楊 頻，張立偉.熒光法研究咖啡酸類藥物與白蛋白的作用[J].科學(xué)通報(bào)，1994，39（1）：31－35

[7]張曉威，趙風(fēng)林，李克安.環(huán)丙沙星與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1999，20（7）：1063－1067.

Fluorescence spectrometric study of the interaction between inositol and bovine serum albumin

WANG Zhi－jun1＊，LIANG Rui－rui1，LEI Hai－ying2

（1.DepartmentofChemistry，ChangzhiUniversity，Changzhi046011，Shanxi，China；2.DepartmentofBiologicalSciencesandBiotechnology，ChangzhiUniversity，Changzhi046011，Shanxi，China）

The interaction between inositol and bovine serum albumin （BSA）at different temperature was investigated by means of fluorescence spectrometry.Quenching constant was obtained，and the effect of inositol on the conformation of BSA was discussed.Moreover，the shortest distance between inositol and BSA was determined based on energy transfer theory.Results show that only dynamic quenching exists between inositol and BSA.

inositol；bovine serum albumin；interaction；fluorescence spectrometry

O 657.39

A

1008－1011（2012）01－0064－03

2011－08－16.

山西省高?？萍奸_發(fā)項(xiàng)目（20081042）和長(zhǎng)治學(xué)院校級(jí)資助項(xiàng)目（2011116）.

王志軍（1980－），男，副教授，博士，主要從事生物無機(jī)化學(xué)研究工作.＊

.