霍韜光，林欣然，暢 蓓，李維凱，楊卉蕾，姜 泓＊

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110001； 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110001）

雄黃對(duì)大鼠腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的影響

霍韜光1，林欣然2，暢 蓓1，李維凱1，楊卉蕾1，姜 泓1＊

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110001； 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110001）

將32只 Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（口服0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液）以及低劑量（0.3g/kg）、中劑量（0.9g/kg）和高劑量（2.7g/kg）雄黃混懸液處理組，通過(guò)4周連續(xù)灌胃給服雄黃混懸液；采用高效液相色譜－電化學(xué)法測(cè)定了大鼠腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量，研究了雄黃對(duì)大鼠腦組織單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的影響.結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，雄黃染毒組大鼠腦組織中NE、DOPAC和DA含量均呈增加趨勢(shì)，而5－HIAA呈降低趨勢(shì).雄黃可對(duì)大鼠腦組織單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響，單胺類(lèi)神經(jīng)能系統(tǒng)可能是雄黃毒性作用的靶點(diǎn)之一.

雄黃；大鼠；腦組織；單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)

雄黃為硫化物類(lèi)礦物，主要成分為二硫化二砷（As2S2）[1]，另外還含有少量As2O3[As（Ⅲ）]和 As2O5[As（Ⅴ）]，為其主要的毒性成分.砷可引起認(rèn)知障礙、智力低下等神經(jīng)行為異常[2]，因此，雄黃及含雄黃中成藥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性已引起了人們的廣泛關(guān)注.單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)重要的信息傳遞物質(zhì)，對(duì)注意力、記憶力和反應(yīng)能力有重要的調(diào)節(jié)作用.檢測(cè)單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，對(duì)研究這類(lèi)遞質(zhì)的生理功能和與遞質(zhì)代謝功能異常有關(guān)的疾病的診斷具有重要意義[3－4].

目前，關(guān)于雄黃對(duì)大鼠腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響還未見(jiàn)報(bào)道.作者采用高效液相色譜－電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定雄黃染毒后大鼠腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量的變化，為探討雄黃對(duì)大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機(jī)制提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與儀器

市售雄黃（成大方圓藥店）；去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5－羥色胺（5－HT）、3，4－二羥基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）、5－羥基吲哚乙酸（5－HIAA）對(duì)照品（Sigma公司）；實(shí)驗(yàn)試劑甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純.初斷乳Wistar大鼠32只（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供），體重50±10g，雌雄各半.

高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），包括600E型輸液泵，2465型電化學(xué)檢測(cè)器，Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站.ER－182A全自動(dòng)電子天平（十萬(wàn)分之一）（日本A＆D公司）；組織勻漿器（IKA廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；3K－18超速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；pH－3C型酸度計(jì)（上海精密科學(xué)實(shí)業(yè)有限公司）；Easypure純水系統(tǒng)（美國(guó)Barnstead公司）.

1.2 色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo ODS column（250mm ×4.6mm i.d.，5μm）；流動(dòng)相組成為緩沖液（30mmol/L檸檬酸三鈉、0.3mmol/L庚烷磺酸鈉，pH 5.0水溶液－甲醇混合液（95∶5，V/V）；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL.參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極為玻碳電極，電極電勢(shì)0.7V.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密稱取NE、DA、5－HT、DOPAC、5－HIAA、HVA對(duì)照品各10mg，用0.1mol/L高氯酸溶解并定容至100mL容量瓶中，得濃度為100mg/L的儲(chǔ)備液.

1.4 動(dòng)物分組及給藥

Wistar大鼠32只，按體重隨機(jī)分成4組，每組8只.以0.5%CMC－Na水溶液為混懸介質(zhì)，對(duì)照組（0.5%CMC）、實(shí)驗(yàn)用藥組（0.3g/kg，0.9g/kg，2.7g/kg）灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥4周.在動(dòng)物灌胃期間每3天稱重1次，調(diào)節(jié)灌胃劑量.所有動(dòng)物均自由飲水和進(jìn)食普通飼料.最后一次灌胃2h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速開(kāi)顱取大腦（冰浴下進(jìn)行）.

1.5 樣品處理方法

稱取腦組織0.1g加入1mL 0.1mol/L高氯酸中勻漿2min，于4℃離心10min（13 000r·min－1），取上清液，過(guò)0.45μm濾膜后進(jìn)樣分析.

1.6 樣品測(cè)定

在上述色譜條件下測(cè)定對(duì)照組及雄黃低、中、高劑量染毒組大鼠腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量.

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用平均值 ±SD表示，用單因素方差分析（ANOVA）比較各染毒組與對(duì)照組大鼠腦組織單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P＜0.05作為檢驗(yàn)的顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

在實(shí)驗(yàn)色譜條件下進(jìn)樣分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液和腦組織樣品的色譜圖見(jiàn)圖1.由圖1可知，6種單胺類(lèi)物質(zhì)在30min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了完全分離，腦組織中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與精密度

精密量取儲(chǔ)備液適量，用0.1mol/L高氯酸稀釋?zhuān)脴?biāo)準(zhǔn)系列溶液.NE、DA、DOPAC的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為：10、20、50、100、200、500mg/L；5－HT、5－HIAA、HVA 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為：50、100、200、500、1 000、2 000mg/L.在實(shí)驗(yàn)色譜條件下，取6種單胺類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL進(jìn)樣分析.以各組分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以各組分的濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/L）進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到線性回歸方程（見(jiàn)表1）.在實(shí)驗(yàn)色譜條件下，連續(xù)6次測(cè)定濃度為200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算6次測(cè)定所得峰面積的RSD值，結(jié)果RSD為0.83%～2.1%，表明儀器精密度良好.

圖1 單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of monoamine neurotransmitters and their metabolites

表1 單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Calibration curves of monoamine neurotransmitters

2.3 回收率

將濃度為100mg/L的6種單胺類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到腦組織勻漿液中，按“樣品處理”項(xiàng)下操作，在實(shí)驗(yàn)色譜條件下分析，用線性回歸方程計(jì)算濃度，用測(cè)得量（測(cè)定值與本底值之差）與加入量之比計(jì)算該方法的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 Result of sample recovery test （n ＝3）

2.4 雄黃染毒大鼠腦組織單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化

對(duì)照組、雄黃染毒組大鼠腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物含量見(jiàn)圖2.在大鼠腦組織中未檢測(cè)到HVA，可能是由于腦組織中HVA含量較低，在本實(shí)驗(yàn)中未被檢測(cè)到.經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)低劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中NE與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，中劑量和高劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中NE含量顯著高于對(duì)照組.低劑量和中劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中DOPAC含量明顯高于對(duì)照組，高劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中DOPAC含量與對(duì)照組比較也有增加的趨勢(shì)但不顯著.雄黃染毒組大鼠腦組織中DA含量與對(duì)照組比較有增加的趨勢(shì)但不顯著；5－HIAA含量與對(duì)照組比較有降低的趨勢(shì)也不顯著.

3 結(jié)論

單胺類(lèi)化合物是哺乳動(dòng)物和人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物，它們?cè)谀X中特定區(qū)域的濃度分布影響著垂體內(nèi)分泌性能的協(xié)調(diào)并直接與神經(jīng)活動(dòng)相關(guān).已有文獻(xiàn)報(bào)道砷可引起腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化[5－10].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠給予雄黃染毒4周后，腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生了變化，NE、DOPAC、DA與對(duì)照組比較有增加的趨勢(shì)，5－HIAA有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明雄黃可對(duì)腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生影響，提示單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)可能是雄黃神經(jīng)毒性的靶點(diǎn)之一.

圖2 腦組織中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量Fig.2 Contents of monoamine neurotransmitters in brain tissues

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Effect of realgar on monoamine neurotransmitters and their metabolites in brain tissues of rat

HUO Tao－guang1，LIN Xin－ran2，CHANG Bei1，LI Wei－kai1，YANG Hui－lei1，JIANG Hong1＊

（1.CollegeofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，Liaoning，China；2.CollegeofClinicalMedicine，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，Liaoning，China）

32Wistar rats were categorized into control group and low dosage，moderate dosage，and high dosage realgar－treated groups.The control group was orally fed with the solution of 0.5%sodium carboxymethylcellulose for 4weeks，while the realgar－treated groups were treated with realgar suspension by gastric perfusion at a dosage of 0.3g/kg，0.9g/kg，and 2.7 g/kg，respectively，for the same duration.The content of monoamine neurotransmitters and their metabolites was determined by means of high performance liquid chromatography equipped with an electrochemical detector，and the effect of realgar on monoamine neurotransmitters and their metabolites in the brain tissues of the rats was investigated.Result shows that the contents of NE，DOPAC and DA in the brain tissues of realgar－treated groups tend to increase while the content of 5－HIAA tends to decrease as compared with the control group.In one word，realgar can affect monoamine neurotransmitters and their metabolites，and monoaminergic system may be one of the toxic targets of realgar.

realgar；rat；brain tissues；monoamine neurotransmitters

O 613.63

A

1008－1011（2012）01－0056－04

2011－07－10.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81073144）；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20092133）；遼寧省教育廳高等學(xué)?？蒲匈Y助項(xiàng)目（L2010708）.

霍韜光（1983－），女，講師，博士，從事含重金屬礦物藥毒作用機(jī)制研究.＊

，E－mail：jianghong＠m(xù)ail.cmu.edu.cn.