鄭海英，蔡少麗，黃平，楊威，黃楊，楊鶴，張愛平，劉小琳，黃建忠

(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福建福州350108)

纖維素酶是指能水解纖維素β-1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，由內(nèi)切β-葡聚糖苷酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3個主要成分組成的誘導(dǎo)型復(fù)合酶系［1-2］。按最適作用pH不同，可分為酸性纖維素酶(最適pH為4.8左右，由綠色木霉、里氏木霉、康氏木霉、黑曲霉、青霉等產(chǎn)生)、中性纖維素酶(最適pH為6～8，由長梗木霉、腐質(zhì)霉、芽胞桿菌等產(chǎn)生)和堿性纖維素酶(最適pH為8～11，由嗜堿芽胞桿菌、腐質(zhì)霉等產(chǎn)生)。中性纖維素酶在紡織、造紙、飼料、食品和制藥等行業(yè)均具有廣泛的應(yīng)用前景［3］，尤其是在牛仔布“洗舊”整理加工方面具有顯著優(yōu)勢［4］。但中性纖維素酶用量大且生產(chǎn)成本高，在一定程度上限制了該酶的開發(fā)與應(yīng)用。因此可以利用分子技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株，優(yōu)化發(fā)酵工藝以提高中性纖維素酶的產(chǎn)量，從而降低成本。目前已有研究報道通過克隆其基因并試圖構(gòu)建重組高產(chǎn)菌株，但仍存在表達量不高等問題［5-6］。本研究擬通過對本課題組已構(gòu)建好的產(chǎn)中性內(nèi)切葡聚糖酶的畢赤酵母基因工程菌EIM-50-eg2的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為該酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株畢赤酵母基因工程菌EIM-50-eg2，工業(yè)微生物教育部工程研究中心克隆表達內(nèi)切中性纖維素酶的高產(chǎn)菌株。

1.1.2 主要試劑和溶液底物溶液、DNS溶液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、葡萄糖標準溶液。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備和菌株培養(yǎng)方法①YPD液體培養(yǎng)基:酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，115℃下高壓滅菌20 min;②MGY液體培養(yǎng)基:酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，甘油10 mL/L，pH 6.0，121℃下高壓滅菌20 min;③MMY液體培養(yǎng)基:酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 7.0，121℃下高壓滅菌20 min;④基礎(chǔ)培養(yǎng)基:硫酸鎂15 g/L，磷酸氫二銨20 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，用氫氧化鉀調(diào)pH至7.0，121℃下高壓滅菌20 min;⑤微量元素PTM1配方:見Invitrogen公司提供的畢赤酵母操作手冊。

1.2 方法

1.2.1 酶活測定方法內(nèi)切中性纖維素酶EGⅡ的活力測定采用DNS法。在15 mL刻度試管中，加入1.8 mL 1.5%羧甲基纖維素鈉溶液。將試管放入恒溫水浴鍋中在50℃水浴預(yù)熱3 min。之后立即加入0.2 mL適當稀釋的酶液，酶解30 min。然后加入3 mL的DNS試劑在沸水中顯色反應(yīng)10 min，迅速冷卻至室溫后加蒸餾水定容至15 mL，充分搖勻后于540 nm波長下測定其吸光值，根據(jù)葡萄糖標準曲線(葡萄糖的絕對量對吸光度數(shù)值作圖)，以每分鐘水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計)所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.2 產(chǎn)酶條件的研究將工程菌EIM-50-eg2接種于3 mL YPD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。以1%接種于含30 mL MGY的250 mL三角瓶中，28℃培養(yǎng)至OD600=2～6。棄上清并將菌體細胞沉淀適量懸浮到MMY培養(yǎng)基中，控制其初始OD600=1。在此過程利用單因素試驗方法優(yōu)化發(fā)酵條件，如誘導(dǎo)時間、氮源、初始pH、發(fā)酵溫度和甲醇誘導(dǎo)濃度等。接著采用L18(3)7正交表進一步優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，具體因素和水平安排見表1。分18個實驗條件，每一個實驗條件設(shè)置3個平行樣，重復(fù)3次，共162組實驗，酶活力取9組實驗平均值。以酶活力高低為優(yōu)化標準，得出1組最適的發(fā)酵條件。

表1 L18(3)7正交試驗因素和水平取值表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of enzyme production optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響

將工程菌EIM-50-eg2接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，3個平行，28℃，230 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定酶活力，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，第2天到第5天呈快速增長趨勢，第5到第7天酶活力小幅度上升，第7天達到最高，以后逐漸下降。

圖1 發(fā)酵時間對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of culture time on yield of enzyme

2.2 氮源對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響

改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮源的種類，培養(yǎng)后測定酶活力，結(jié)果見圖2。由圖2可知，酵母粉和蛋白胨的混合物、磷酸氫二銨作為氮源的酶活明顯高于其他原料發(fā)酵所產(chǎn)生的酶活。綜合考慮成本和酶活因素，最后選用磷酸氫二銨作為工程菌的氮源。

圖2 不同氮源對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on yield of enzyme

2.3 磷酸氫二銨濃度對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響

氮源濃度決定培養(yǎng)基的碳氮比，直接影響到工程菌EIM-50-eg2菌體的生長和產(chǎn)酶。氮源濃度對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，在較低濃度的氮源里，酶活力隨著氮源濃度的升高而增加，氮源濃度為4%時，酶活力達到最高，之后隨濃度增加中性內(nèi)切纖維素酶酶活迅速降低。

圖3 不同磷酸氫二銨濃度對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of(NH4)2HPO4concentration on yield of enzyme

2.4 培養(yǎng)基初始pH對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響

實驗分別考察了培養(yǎng)基初始pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，初始pH為6.0時內(nèi)切中性纖維素酶EGⅡ的活力最高。初始pH過低或過高，酶的活性均降低。這可能是因為過低的初始pH會影響細胞膜的通透性，影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和外源蛋白的分泌，并最終嚴重影響工程菌的表達［7］。過高的初始pH值則會影響發(fā)酵液中蛋白酶的活性而不利于某些蛋白的分泌［8-10］。

圖4 初始pH值對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of initial pH on yield of enzyme

2.5 誘導(dǎo)溫度對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響

選擇酵母菌適宜生長的溫度范圍(24～30℃)對工程菌的產(chǎn)酶進行探討。由圖5可知最適的發(fā)酵溫度為28℃。發(fā)酵溫度對工程菌的生長和合成內(nèi)切中性纖維素酶EGⅡ有至關(guān)重要的影響。溫度過高會造成細胞內(nèi)的活性物質(zhì)發(fā)生變性，嚴重抑制微生物的代謝循環(huán)，溫度過低則不利于菌體生長［11-12］。

圖5 溫度對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of temperature on yield of enzyme

2.6 甲醇誘導(dǎo)濃度對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響

不同濃度的甲醇誘導(dǎo)對工程菌產(chǎn)酶量的影響，結(jié)果見圖6。甲醇誘導(dǎo)濃度為1.5%時，產(chǎn)酶量達到最高，接著逐漸下降。這可能是因為甲醇濃度太低導(dǎo)致碳源不足，所以產(chǎn)酶量低;過高的甲醇對細胞產(chǎn)生了毒害，抑制酶的產(chǎn)生［13］。

圖6 不同濃度甲醇對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of methanol concentration on yield of enzyme

2.7 PTM1對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響

如圖7所示，比較加PTM1與不加PTM1發(fā)酵液的酶活力，前者明顯高于后者，這說明一定濃度的PTM1能夠明顯提高內(nèi)切中性纖維素酶的表達量。由圖7可知，0.02%的濃度最適于菌體產(chǎn)酶?？赡苁俏⒘吭刂泻蠧a2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+等金屬離子，有助于提高細胞濃度、產(chǎn)率等。隨著PTM1濃度增加，酶活力反而下降。可能是由于微量元素溶液中的金屬離子如Ca2+、Fe3+等易與磷酸緩沖液中的作用產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致磷酸緩沖液中的和向電離產(chǎn)生和H+的方向進行，使得溶液中的H+濃度增加，導(dǎo)致pH值下降，最終抑制菌株生長和產(chǎn)酶。

圖7 不同PTM1濃度對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of PTM1concentration on yield of enzyme

2.8 正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果

由表2可知，甲醇和溫度的極差分居第1位和第2位，是影響酶活的關(guān)鍵性因子，磷酸氫二銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、pH的極差都較小。比較正交表排列的18種培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力大小，以17號培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力最高，即該菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的較優(yōu)組合為磷酸氫二銨4%，甲醇1.5%，硫酸鎂1%，磷酸二氫鉀0.9%，pH 6.0，溫度28℃。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test of enzyme production optimization

結(jié)果(表3)表明，試驗的所有因子都是主要影響因素，其中甲醇誘導(dǎo)濃度和溫度達到極顯著水平(P＜0.01)，磷酸氫二銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和pH達到了顯著水平(P＜0.05)。

續(xù)表2

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

3 結(jié)論

本研究通過對工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)內(nèi)切中性纖維素酶發(fā)酵條件進行了研究，得到該工程菌最佳氮源是磷酸氫二銨，最適濃度4%，硫酸鎂1%，磷酸二氫鉀0.9%，最佳初始pH為6.0，最佳甲醇誘導(dǎo)濃度1.5%，最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶溫度為28℃，最適微量元素PTM10.02%。在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用正交實驗優(yōu)化發(fā)酵條件，工程菌EIM-50-eg2產(chǎn)內(nèi)切中性纖維素酶EGⅡ酶活力從原來的1 449 U/(mL·min)提高到4 158 U/(mL·min)，酶活力提高了約2.86倍。

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