王秋艷，趙景紅，徐楊，鄭秋月，趙昕

(遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001)

麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制*

王秋艷，趙景紅，徐楊，鄭秋月，趙昕

(遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001)

將麻痹性貝類毒素陽性的新鮮扇貝去殼后取貝肉，經(jīng)過勻漿，冷凍干燥等步驟制備成凍干粉，然后進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，制備后的樣品均勻，穩(wěn)定，滿足標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。以多家實(shí)驗(yàn)室定值的方式對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定值，定值結(jié)果為（589±42）MU/g（k=2）。該標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于麻痹性貝類毒素檢測(cè)過程的方法驗(yàn)證與質(zhì)量控制。

麻痹性貝類毒素；標(biāo)準(zhǔn)樣品；小鼠生物法；扇貝

麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poison，PSP）是指化學(xué)結(jié)構(gòu)以石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）為代表，攝食后可產(chǎn)生麻痹作用存在于貝類體內(nèi)的海洋生物毒性物質(zhì)的總稱［1］。自1992年愛爾蘭北島發(fā)生貝類中毒事件并首次被確認(rèn)為麻痹性貝類毒素以來，全世界每年都有該類毒素引起中毒事件的報(bào)道。目前，PSP是世界上分布最廣、食物中毒發(fā)生頻率最高、危害程度最大的一類毒素［2］，因此對(duì)于貝類中麻痹性貝類毒素的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和控制已成為世界各國關(guān)注的焦點(diǎn)，也是貝類產(chǎn)品檢測(cè)的重點(diǎn)。

目前，麻痹性貝類毒素的測(cè)定方法有小鼠生物法［3，4］、高效液相色譜法［5］、液質(zhì)法、酶聯(lián)免疫分析法［6］等。由于缺少貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，檢測(cè)方法的驗(yàn)證、質(zhì)量控制及定量等都難以進(jìn)行。因麻痹性貝類毒素為劇毒物質(zhì)，世界各國對(duì)貝類毒素的出入境有嚴(yán)格的控制管理規(guī)定，國際上只有加拿大等國有少量生產(chǎn)，價(jià)格昂貴，貨期長。另外貝類毒素種類繁多，極不穩(wěn)定，難以保存。我國目前尚無有關(guān)麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的報(bào)道。筆者以天然污染的有毒貝類為原料，經(jīng)制備得到實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品，該標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻、穩(wěn)定，易保存，有利于對(duì)貝類毒素的有效監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器與材料

中試凍干機(jī)：Epsilon 2– 6D型，德國CHRiST公司；

離心機(jī)：SORVALL型，德國Biofuge公司；

電子天平：BP221S型，德國賽多利斯公司；I

CR小鼠：購自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心；

實(shí)驗(yàn)所用其余試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品制備

對(duì)采自黃渤海海域生長的扇貝樣品，用小鼠生物法［3，4］檢測(cè)其中 PSP 含量，取 PSP 陽性的扇貝，用清水將貝殼外表徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用重蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其它外來物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，仔細(xì)切取全部貝肉，加入蒸餾水及少許0.18 mol/L 鹽酸溶液，均質(zhì)，混勻，置于–80℃預(yù)凍至少4 h，真空冷凍干燥得到粗樣，將粗樣研磨過篩，得到凍干粉。在無菌操作間中，將上述方式獲得的扇貝凍干粉分裝于經(jīng)160℃干熱處理2 h潔凈的5 m L棕色西林瓶中封蓋密封，加貼唯一性標(biāo)識(shí)，凍存。

（2）檢測(cè)方法

精確稱取500mg（精確到0.1 mg）凍干粉移入燒杯中，用20m L 0.18 mol/L 鹽酸溶液分幾次反復(fù)沖洗西林瓶，最終合并到燒杯中制備成混懸樣本，再加入約80m L蒸餾水，充分混合，調(diào)節(jié)至pH 2.0～4.0。將混合物加熱，并徐徐煮沸5 m in，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)至pH 2.0～4.0。將該混合液定容到100m L，以4 000r/m in離心5 m in，取上清液作為待測(cè)液（原液），按照標(biāo)準(zhǔn)方法［3，4］進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果報(bào)告單位為MU/g。

2 均勻性檢驗(yàn)

從樣品中隨機(jī)抽取15瓶，每瓶樣品重復(fù)測(cè)試兩次，分析標(biāo)準(zhǔn)樣品的PSP含量。所有試料以隨機(jī)次序在重復(fù)性條件下測(cè)試，即在同一實(shí)驗(yàn)室中由相同的人員使用相同的測(cè)試方法和儀器在較短時(shí)間內(nèi)測(cè)試［7］，用鼠單位表述的麻痹性貝類毒素的對(duì)數(shù)值呈正態(tài)分布，因此在所有的統(tǒng)計(jì)方法中均使用結(jié)果的對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。15瓶麻痹性貝類毒素的均勻性檢測(cè)結(jié)果列于表1。

表1 麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。從表2結(jié)果可知，統(tǒng)計(jì)量F比為1.30，當(dāng)α=0.05，f1=14，f2=15，查 F 分布表可知，F(xiàn)臨界值為 2.42。因統(tǒng)計(jì)量F比小于F臨界值，說明在95%的置信區(qū)間，樣品內(nèi)及樣品間無顯著性差異，樣品均勻性良好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表2 麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻檢驗(yàn)結(jié)果

3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

按照時(shí)間間隔前密后疏的抽樣原則，分別在第0，2，4，7，10，16，22，28 個(gè)月每次隨機(jī)選取 3 個(gè)樣品進(jìn)行PSP測(cè)定。利用直線經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鰳悠返姆€(wěn)定性。麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果見表3、表4。從表4可知，;b1; 1t0.95,n-2s( b1)，故斜率不顯著，表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定期至少為2年。

表3 麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果（一）

表4 麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果（二）

4 定值分析

參照ISO導(dǎo)則34［8］的要求，從出入境檢驗(yàn)檢疫局、農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室及科研院校等單位選擇8家具有麻痹性貝類毒素檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)抽取5瓶樣品采用統(tǒng)一的測(cè)定方法對(duì)樣品進(jìn)行定值分析，定值分析結(jié)果見表5。

表5 麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果匯總表

對(duì)各家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)取對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)每家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，采用夏皮羅–威爾克（Shapiro–Wilk）法檢驗(yàn)表5中數(shù)據(jù)，正態(tài)性檢驗(yàn)按下式計(jì)算：

通過計(jì)算，統(tǒng)計(jì)量W為0.946，大于臨界值W（40，0.95）=0.94，表明檢測(cè)結(jié)果均服從正態(tài)分布。用Grubb’s法檢驗(yàn)，確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無異常值。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步統(tǒng)計(jì)，用Cochran檢驗(yàn)各家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)的方差內(nèi)是否包含不明原因引入的系統(tǒng)誤差，檢驗(yàn)公式為：

其中sj為各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，smax為sj中的最大值。經(jīng)計(jì)算C=0.262，查表可知，C(n=5，p=8，0.05)為0.391，表明所有的數(shù)據(jù)均通過檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)室測(cè)試精度一致，因此計(jì)算總算術(shù)平均值作為麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的結(jié)果。

5 定值不確定度評(píng)定

8家實(shí)驗(yàn)室分析結(jié)果的平均值分別為2.767，2.789，2.763，2.762，2.756，2.772，2.771，2.773。該標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要由3部分組成：標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值過程引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)樣品的不均勻性引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)樣品的不穩(wěn)定性引入的不確定度。定值數(shù)據(jù)及均勻性、穩(wěn)定性引入的不確定度分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6。

采用標(biāo)準(zhǔn)值±擴(kuò)展不確定度的方式表示標(biāo)準(zhǔn)樣品的值為 (2.77±0.03)，k=2。

將結(jié)果換算成小鼠單位，則麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為：(589±42) MU/g，k=2。

表6 麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果及不確定度

6 結(jié)論

研制的痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性和穩(wěn)定性良好，量值可靠，通過了全國標(biāo)準(zhǔn)樣品委員會(huì)的評(píng)審。該標(biāo)準(zhǔn)樣品可以滿足實(shí)驗(yàn)室間麻痹性貝類毒素測(cè)試項(xiàng)目的能力驗(yàn)證活動(dòng)及定性、定量檢測(cè)的要求，可用于檢測(cè)方法的驗(yàn)證、測(cè)試儀器的校準(zhǔn)、測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量控制與考核，保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可比性，為食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)及衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫等方面的測(cè)量和研究工作提供了技術(shù)支撐和量值溯源保障。

［1］Cim iniello P，F(xiàn)attorusso E. Shellfish toxins-chem ical studies on northern Adriatic mussels［J］.Eur J Org Chem，2004(12):2 533–2 551.

［2］Kodama M. Paralytic shellfish poisoning toxins：biochem istry and origin［J］. Aqua-Bioscience Monographs，2010，3(1): 1–38.

［3］AOAC official method 958.08 Paralytic Shellfish Poison：Biological method ［S］.

［4］GB/T 5009.213–2008 貝類中麻痹性貝類毒素的測(cè)定［S］.

［5］AOAC official method 2005.06 Paralytic Shellfish Poisoning toxins in shellfish ［S］.

［6］SN/T 1773–2006 進(jìn)出口貝類中麻痹性貝類毒素檢驗(yàn)方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法［S］.

［7］中國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)全國標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì).標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)用手冊(cè)［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［8］ISO Guide 34 ：2000General requirements for the competence of reference meterial producers［S］.

Preparation of Paralytic Shellfi sh Poison Reference M aterial

Wang Qiuyan, Zhao Jinghong, Xu Yang, Zheng Qiuyue, Zhao Xin
(Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China)

Scallop, naturally contaminated w ith paralytic shellfish poison (PSP) toxins were collected and the shells were opened. Meat were removed, homogenized and lyophilized. Homogeneity and stability testing results showed that the PSP reference material was homogeneous and stable. The certification value was the average assigned by eight laboratories,The PSP content and its expanded uncertainty was (589±42) MU/g（k=2）. The PSP reference material can be used in the method evaluation and quality control in the determ ination of PSP.

paralytic shellfish poison; reference material; mouse biological method; scallop

O652.3

A

1008–6145(2012)02–0004–03

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.02.001

*國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011IK118)；大連市優(yōu)秀青年科技人才基金項(xiàng)目(2009J22DW 035)

聯(lián)系人：王秋艷；E-mail: lndlwqy@163.com

2011–12–22