保志娟，周瑾艷，楊亦

（廣東省計(jì)量科學(xué)研究院，廣東 510405）

高效液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸的不確定度評定*

保志娟，周瑾艷，楊亦

（廣東省計(jì)量科學(xué)研究院，廣東 510405）

采用高效液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸的含量，對測量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)和測量重復(fù)性是測量過程中不確定度的主要來源，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)對合成不確定度的影響最大。當(dāng)氨基酸口服液中L-色氨酸的測定結(jié)果為8.8 μg/mL時，其擴(kuò)展不確定度為1.1 μg/mL。

L-色氨酸；高效液相色譜法；氨基酸口服液；測量不確定度

色氨酸通常以游離或結(jié)合態(tài)廣泛存在于生物體中，是人類和動物必需的8種氨基酸之一。人體不能制造它，而必須從膳食中攝?。?，2］。色氨酸對生物的生長和氮平衡非常重要，色氨酸缺乏或代謝錯誤會引起一系列疾?。涣硪环矫?，色氨酸也可作為疾病的治療藥物。隨著人們對健康的重視，各種氨基酸保健食品越來越被大眾熟悉和接受。

準(zhǔn)確測定保健食品中的色氨酸含量，對評價保健品質(zhì)量、指導(dǎo)用戶選購意義重大。筆者利用液相色譜二極管陣列法定量測定了氨基酸口服液中L-色氨酸的含量，并根據(jù) 《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》［3］和《測量不確定度評定與表示》［4］，對測量的不確定度進(jìn)行了評定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Alliance 2675型，配2998型二極管陣列檢測器,美國Waters 公司；

L-色氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW(E) 100260，純度為（99.7±0.7）%，廣東省計(jì)量科學(xué)研究院；

L-色氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)儲備液：100 μg/mL，精密稱取約5.00 mg L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并準(zhǔn)確定容至50 mL，于4℃冰箱中保存；

甲醇：色譜純；

水：超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm；

氨基酸口服液：10 mL/支，市售。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：280 nm；流動相：甲醇(A)–水(B)；梯度洗脫程序：流動相A初始值體積分?jǐn)?shù)為30%（保持2 min），2～10 min內(nèi)A體積分?jǐn)?shù)由30%變化為70%，10～14 min，A體積分?jǐn)?shù)由70%變化至40%，14～15 min，B由體積分?jǐn)?shù)40%變化至30%；流速：1.0 mL/min。環(huán)境溫度：(20±5)℃；相對濕度：不大于70%。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

取市售氨基酸口服液1支，搖勻，準(zhǔn)確移取1.0 mL，置于10 mL容量瓶中定容，用0.45μm濾膜過濾，上機(jī)測試，用外標(biāo)曲線法定量。

2 測量不確定度來源

高效液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸含量的不確定度主要來源：L-色氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)、樣品處理、色譜峰面積測量及重復(fù)性測量。

3 數(shù)學(xué)模型

氨基酸口服液中L-色氨酸的濃度可表示為：

式中：csp——樣品溶液中L-色氨酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；

Ax——樣品溶液中L-色氨酸的色譜峰面積，μV·s；

c0——標(biāo)準(zhǔn)工作液中L-色氨酸的質(zhì)量體積濃

度，μg/mL；

Vsp——氨基酸口服液的定容體積，mL；

A0——標(biāo)準(zhǔn)工作液中L-色氨酸的色譜峰面積，μV·s；

4 測量不確定度評估［3，4］

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)引入的不確定度

分別取50，100，300，500 μL及1.0，2.0 mL的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容，搖勻，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2儀器工作條件進(jìn)行分析。

對以上6種濃度的L-色氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測定6次，得到相應(yīng)的峰面積，并計(jì)算峰面積平均值，測定結(jié)果列于表1。

表1 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積

用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度–峰面積校準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=14 055.9c –2 751.99 ，相關(guān)系數(shù)r =0.999 94。在標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中，L-色氨酸的濃度為c0時測量所產(chǎn)生的不確定度u(c0)為：

式中：s——標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

b1——校準(zhǔn)曲線的斜率；

p——被測樣品的測量次數(shù)，p=6；

n——6種標(biāo)準(zhǔn)溶液總測試次數(shù)，n =36；

c0——L-色氨酸樣品溶液對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的濃度，c0=0.880 109 μg/mL；

Ai——標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積；

ci——標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，μg/mL。

將表1中的數(shù)據(jù)代入式（2）、式（3）計(jì)算求得u(c0)=0.051 98 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液中L-色氨酸的質(zhì)量體積濃度c0的不確定度僅與峰面積不確定度有關(guān)，而與標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度無關(guān)，也不與從同一溶液中逐次稀釋產(chǎn)生必然的相關(guān)性［3］，故標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)溶液所產(chǎn)生的不確定度可以忽略,urel(c0)=u(c0)/c0=0.059 06。

4.2 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度引入的不確定度

（1）L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書標(biāo)示的純度P為（99.7±0.7）%，取容量因子k=2，則L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P)=0.007/k =3.5×10–3，urel(P)=u(P)/P=3.51×10–3。

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

檢定證書給出了天平的最大允許誤差為±0.01 mg。標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量應(yīng)重復(fù)計(jì)算兩次，一次是空盤，另一次為毛重，因?yàn)槊恳淮畏Q量均為獨(dú)立的觀測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)實(shí)際稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.02 mg,由此得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)=0.008 2 mg，則urel(m)=0.008 2/5.02=1.633×10–3。

（3）標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液定容體積引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)儲備液定容使用50 mL單標(biāo)線A級容量瓶，定容體積引入的不確定度u(V)由以下兩項(xiàng)合成得到：

①容量瓶的體積引入的不確定度u1(V)。檢定證書給定容量允差為±0.05 mL，按照矩形分布計(jì)算，不確定度分量= 0.028 87（mL）。

②實(shí)驗(yàn)溫度波動引入的容量瓶體積不確定度u2(V)。實(shí)驗(yàn)室的溫度波動范圍為±5℃，水的熱膨脹系數(shù)為2.1×10–4/℃，按矩形分布計(jì)算，=0.030 3（mL）。

合并以上兩項(xiàng)，得標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液定容體積引入的不確定度：

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)可由urel(P)，urel(m)，urel(V) 3項(xiàng)合成而得：

4.3 樣品處理引入的不確定度

移液管和容量瓶定容不確定度來源：排出或定容體積的重復(fù)性、體積校準(zhǔn)時的不確定度以及由實(shí)驗(yàn)室溫度與取樣器皿校準(zhǔn)時溫度不一致而帶來的不確定度，其中排出或定容體積的重復(fù)性歸入整個測試程序統(tǒng)一考慮。

體積校準(zhǔn)不確定度：取樣采用1 mL的A級移液管，定容時采用10 mL的A級容量瓶。按照檢定規(guī)程JJG 196–2006要求，1 mL移液管的最大允許誤差為0.008 mL，10 mL容量瓶的最大允許誤差為0.02 mL，近似為矩形分布。則移液管的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為（mL），容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.011 5 mL。

溫度引入的不確定度：實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際溫度波動范圍為±5℃，1 mL移液管標(biāo)準(zhǔn)不確定度為（mL），10 mL容量瓶標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=6.06×10–3（mL），則氨基酸口服液取樣體積的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品定容體積引入的的不確定度u(V2)為：

4.4 色譜峰面積引入的不確定度

根據(jù)儀器說明書和積分儀的一般性能指標(biāo)分析，目前用于液相色譜儀色譜峰面積積分處理的最大誤差為0.2%～1%，取1%，按均勻分布考慮，則色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.5 重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

對氨基酸口服液樣品進(jìn)行6次重復(fù)測量，測量覆蓋本方法的全過程，同時反映稱量、體積等分量的重復(fù)性。測得樣品含量分別為8.17，9.06，8.83，9.07， 8.80，8.87 μg/mL，平均值=8.80 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差s =0.329 μg/mL。

因此，重復(fù)性引入的相對不確定度為：

4.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由式(4)合成：

把相關(guān)數(shù)據(jù)代入(4)式，求得urel(w)=0.061 9，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u (w)=urel(w)×w =0.55 μg/mL。

4.7 計(jì)算擴(kuò)展不確定度

取置信水平P =95%，包含因子k =2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度U =k×u (w)=1.1 μg/mL。

5 結(jié)果表示

氨基酸口服液中L-色氨酸測量結(jié)果可以表達(dá)為：w =(8.8 ±1.1)μg/mL。

6 結(jié)論

分析結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)及樣品測定的重復(fù)性是液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸含量的主要不確定度來源，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)對總不確定度的影響最大。原因是由于測試樣品的濃度接近檢測限，樣品測試的重復(fù)性變差，通過選擇合適的、可行的試驗(yàn)方案，譬如富集樣品中L-色氨酸等可以有效減小不確定度，保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

［1］ Mackay G M, Forrest C M, Stoy N, et al.Tryptophan metabolism and oxida tive stress in patients with chronic brain injury［J］.Eur J Neurol，2006(13): 30–42.

［2］ Agazzi A, Ponti F D, Giorgio R D, et al.Review of the implications of dietary tryptophan intake in patient with irritable bowel syndrome and psychiatric disorders［J］.Dig Liver Dis，2003，35(8): 590–595.

［3］ CNAS–GL06：2006 化學(xué)分析中不確定度的評估指南［S］.

［4］ JJF 1059–1999 測量不確定度評定與表示［S］.

Uncertainty Evaluation of Determinnation of L-Tryptophan in Amino-Acid Oral Liquid by HPLC

Bao Zhijuan， Zhou Jinyan， Yang Yi
(Guangdong Institute of Metrology， Guangdong 510405， China)

L-trypotphan (TRP) in amino-acid oral liquid was detected by HPLC，and the measurement uncertainty was evaluated. The results indicated that the calibration of the standard curve and repeatability mainly affected the measurement uncertainty of L-TRP in amino-acid oral liquid. The calibration of the standard curve was the largest contribution to the whole measurement uncertainty. As the content of L-TRP was 8.8 μg/mL，the expanded uncertainty was 1.1 μg/mL.

L-tryptophan; HPLC; amino-acid oral liquid; measurement uncertainty

O657.7

A

1008–6145(2012)02–0014–03

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.02.004

* 廣東省質(zhì)監(jiān)局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010CB01）

聯(lián)系人：保志娟；E-mail: baozhij@yahoo.com.cn

2011–10–20