李勝利 朱宏亮 劉全征 王瑋 劉琦 史士合 劉艷平 王福田 李憲德

有研究表明，豚鼠慶大霉素(gentamyci,GM)中毒后耳蝸毛細(xì)胞具有一定程度的再生修復(fù)能力[1]。劉冰等[2]證明GM耳中毒后豚鼠存活4周者耳蝸毛細(xì)胞微絨毛密集, 但不規(guī)則, 未發(fā)現(xiàn)不成熟的小纖毛束。沈嘯洪等[3]給豚鼠肌肉注射卡那霉素造成耳聾模型后，用中藥補腎聰耳片治療后多數(shù)毛細(xì)胞聽毛排列整齊, 極少數(shù)聽毛倒伏紊亂, 扭曲變形, 缺損明顯減少, 基底膜恢復(fù)完整, 亦可見到絨纖毛, 表明其聽毛細(xì)胞有修復(fù)現(xiàn)象。侯建平等[4]的實驗結(jié)果表明茯苓可減輕豚鼠卡那霉素中毒性耳損害。倪月秋[5]采用GM 致聾制作動物模型，然后用中藥川芎嗪( tmtramethylpyrazine，TMP) 進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎嗪對豚鼠耳蝸受損毛細(xì)胞有修復(fù)作用。崔城等[6]同樣發(fā)現(xiàn)川芎嗪對慶大霉素中毒耳蝸毛細(xì)胞和血管紋具有保護作用。而徐紹勤等[7]用中藥復(fù)聰片對慶大霉素耳中毒豚鼠治療20天后發(fā)現(xiàn)其可促使受損毛細(xì)胞形態(tài)及功能在一定程度上恢復(fù)。鐘渠等[8]用聰耳合劑治療感音神經(jīng)性聾，結(jié)果治療組(兩個療程共30天)總有效率(82．36%)明顯高于對照組(59.38%)，說明聰耳合劑治療感音神經(jīng)性聾安全有效。倪月秋[5]認(rèn)為中藥在治療感音性聾方面取得了很大成就，并指出中藥對人類內(nèi)耳毛細(xì)胞再生影響的研究將會取得突破性的進展，從而為治療感音神經(jīng)性聾開辟一條嶄新的道路。

本課題組研制的純中藥制劑復(fù)聰湯Ⅰ號口服液和復(fù)聰湯Ⅱ號滴耳液，秉承祖國醫(yī)藥的傳統(tǒng)，在口服全身治療的同時，外耳道局部進行藥浴治療，在部分動物和聾兒治療獲得一定療效后，進行了本實驗研究，發(fā)現(xiàn)該純中藥制劑可使慶大霉素致聾動物的聽功能部分恢復(fù)，對耳蝸受損的毛細(xì)胞有一定的修復(fù)再生作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及造模方法 選用健康青年雜色豚鼠73只(西安交通大學(xué)實驗動物中心)，耳廓反射正常，體重250～300 g,雌雄各半。動物分為慶大霉素致聾組(GM組)53只和正常對照組20只。兩組動物用戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉，進行ABR和DPOAE檢測。GM組按80 mg·kg-1·d-1肌肉注射慶大霉素(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，2 ml,8萬單位)，連續(xù)注射30天，期間因中毒嚴(yán)重死亡動物8只，剩余的45只動物在擊掌耳廓反應(yīng)減弱或消失情況下，檢測ABR反應(yīng)閾在60 dB SPL以上、DPOAE幅值明顯下降后，再分為致聾后中藥治療組(25只)和致聾后對照組(20只)。正常對照組給予肌肉注射同樣劑量及療程的生理鹽水。

在連續(xù)治療30、60和90天后，分別檢測中藥治療組和致聾后對照組動物的ABR、DPOAE，然后于各時間點分別取6只動物麻醉后處死，右側(cè)耳蝸行硝酸銀染色耳蝸鋪片，左側(cè)耳蝸用2.5%戊二醛固定后行掃描電鏡觀察。

1.2豚鼠致聾后治療方法 根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》中的方法[9]，按成人量(mg/kg)換算成動物劑量的倍數(shù)簡表，換算豚鼠為4.5倍的劑量(mg/kg)，計算出豚鼠的口服用藥劑量約為10 ml。中藥“復(fù)聰湯Ⅰ號”的主要成分為：桃仁、穿山甲、紅花、川芎、黃芪、萊菔子、烏藥、木香等水煎劑；“復(fù)聰湯Ⅱ號”的主要成分為：冰片、茯苓、桂圓和麝香等的水提取液。致聾后中藥治療組從致聾成功后開始每天口服復(fù)聰湯Ⅰ號10 ml，并予復(fù)聰湯Ⅱ號外耳道藥浴兩次，連續(xù)30、60和90天。致聾后對照組每天口服相同劑量的生理鹽水并外耳道每天滴生理鹽水兩次,療程同中藥治療組。

1.3ABR和DPOAE檢測方法 檢測儀器為美國Inteligent Hearing Smart3聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射儀。ABR檢測：動物麻醉后，用針電極插入顱頂作為記錄電極，同側(cè)為參考電極，對側(cè)接地。刺激率19.1次/毫秒,高通300 Hz，低通3 000 Hz，平均疊加256～512次。DPOAE檢測：兩個初始音強度分別為L1=L2=70 dB SPL的純音信號，f1/ f2=1.22，f1、f2的幾何均數(shù)的范圍位于0.5～8.0 kHz。測量不同刺激強度時DPOAE的幅值，以反應(yīng)幅值高出本底噪聲3 dB作為DPOAE引出，確定檢出率。上述測試均疊加100次。

1.4耳蝸鋪片及觀察方法 動物在麻醉狀態(tài)下，快速斷頭，迅速取出右側(cè)聽泡，分離出耳蝸，在解剖顯微鏡下(OLYMPUS,TOKYO,297261)，用纖細(xì)鋼針在耳蝸尖頂鉆一小孔，將前庭膜挑破，再挑破圓窗膜和卵圓窗膜，并在耳蝸底回骨隆起處鉆一小孔，吸取0.5%的硝酸銀溶液從蝸尖的小孔和兩窗及底回的小孔反復(fù)灌入用雙蒸水洗滌數(shù)次，再灌入10%的福爾馬林固定液。標(biāo)本在日光下曝光2～4小時后，解剖顯微鏡下分離基底膜并鋪片，光鏡下從耳蝸基底部的溝回開始，逐個視野向頂回對正常存活毛細(xì)胞計數(shù)(正常外毛細(xì)胞呈明顯完整的“V”形)，同時計數(shù)出消失的毛細(xì)胞數(shù)和嚴(yán)重變性的毛細(xì)胞數(shù)(嚴(yán)重變性的毛細(xì)胞為表皮板腫脹凸起，呈“皰疹”樣，未見靜纖毛束)。

1.5掃描電鏡觀察方法 將取材的左側(cè)耳蝸樣品用緩沖液洗凈，在解剖顯微鏡下(OLYMPUS,TOKYO,297261)用纖細(xì)鋼針在耳蝸頂部打一小孔，一定要挑破前庭膜，再挑破圓窗膜和卵圓窗膜，并去除鐙骨及足板，用細(xì)滴管將2.5%戊二醛固定液從蝸尖小孔和圓窗卵圓窗反復(fù)滴灌3～5次，將樣品浸泡在固定液中，置于4 ℃冰箱中4小時。置于0.1 M PBS緩沖液中，在解剖顯微鏡下行耳蝸各回骨壁鉆孔，使耳蝸各回與固定液相通，再浸泡于固定液中4小時。用0.1 M PBS漂洗三次后，用1% OsO4后固定2小時。用0.1 M PBS漂洗20～30分鐘。梯度乙醇脫水，乙醇與乙酸異戊酯1:1的混合液10～20分鐘；純乙酸異戊酯10～20分鐘。臨界點干燥后，即可取出樣品。將樣品置于解剖顯微鏡下，去除覆蓋于觀察部位的骨質(zhì)和膜性結(jié)構(gòu)，清潔樣品后，將樣品用雙面膠帶固定于樣品臺上，離子濺射鍍膜。掃描電鏡觀察在S-2700 Scanning Election Microscope HITACHI下進行。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用Microsoft Office Excel 錄入數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0 for Window軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1DPOAE檢測結(jié)果 實驗前所有動物DPOAE幅值正常(5.7～30.8 dB SPL)，GM致聾后，在中高頻率區(qū)(1 005～8 000 Hz)DPOAE幅值明顯降低(P<0.05)，中藥治療30天后DPOAE幅值上升明顯，尤其在GM損害嚴(yán)重的中高頻區(qū)(1 000～4 000 Hz)；中藥治療60天后，中高頻區(qū)DPOAE幅值上升但不顯著；中藥治療90天后，高頻區(qū)幅值上升明顯，與GM致聾后和治療30天時相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與實驗前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明中藥治療90天使GM致聾豚鼠耳蝸的DPOAE幅值基本恢復(fù)正常(表1)。

致聾后對照組豚鼠DPOAE幅值明顯下降，生理鹽水治療30、60和90天后，低中頻率區(qū)(500～1 500 Hz)DPOAE幅值逐步恢復(fù)，而中頻到高頻段(2 800～8 000 Hz)DPOAE幅值仍在逐步下降，到90天時下降更為明顯，說明GM致聾后隨恢復(fù)時間延長豚鼠低中頻區(qū)DPOAE幅值可有部分恢復(fù)，而高頻區(qū)持續(xù)下降(表2)。

正常對照組30、60和90天時DPOAE幅值逐漸下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

2.2ABR檢測結(jié)果 實驗前各組的ABR平均閾值為20～25 dB SPL，GM致聾后ABR閾值上升到40～80 dB SPL，平均為 50 dB SPL左右，與實驗前相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥治療30、60和90天后，治療組總體ABR的平均閾值由30 dB SPL左右逐漸下降到 25 dB SPL左右，較致聾后明顯下降(P<0.01)，較實驗前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后30、60和90天時自身比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。致聾后對照組生理鹽水治療30、60和90天后，總體的ABR平均閾值與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，基本維持在GM致聾后的50 dB SPL左右水平(表4)。

表1 GM致聾后中藥治療組實驗前、致聾后及中藥治療30、60和90天DPOAE各頻率幅值

注：*與實驗前比較，P<0.05；**與治療30天比較，P<0.01

表2 GM致聾后對照組實驗前、致聾后及生理鹽水治療30、60和90天DPOAE各頻率幅值

注：*與實驗前比較，P<0.05

表3 正常對照組實驗前及自然恢復(fù)30、60和90天DPOAE各頻率幅值

表4 實驗前后致聾后中藥治療組、致聾后對照組ABR反應(yīng)閾

注：*與同組其他各時間點比較，P<0.05；**與實驗前及治療后30、60、90天比較，P<0.05

正常對照組在30、60和90天時ABR反應(yīng)閾僅有小幅上升，但與實驗前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3耳蝸鋪片觀察結(jié)果 慶大霉素致聾后，豚鼠耳蝸基底回(第一回)的內(nèi)外毛細(xì)胞基本損失，第二回亦有40%～80%的外毛細(xì)胞損失，第三回及第四回有一半的外毛細(xì)胞損失。中藥治療30天后，耳蝸基底回的毛細(xì)胞數(shù)目明顯增多，接近正常數(shù)的一半(圖1a)；第三回僅有散在的毛細(xì)胞缺失，毛細(xì)胞缺失部位出現(xiàn)許多增生的支持細(xì)胞(圖1b、c)。而致聾后對照組耳蝸基底回毛細(xì)胞幾乎全部消失(圖1d),耳蝸第三、四回也有80%的毛細(xì)胞消失,同時出現(xiàn)許多正在損害的變性細(xì)胞(圖1e、f)。

圖1 慶大霉素致聾后中藥治療30天及致聾后對照組豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損害及增殖修復(fù)情況

圖2 慶大霉素致聾后中藥治療60天及致聾后對照組豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損害和增殖情況

圖3 慶大霉素致聾后中藥治療90天及致聾后對照組豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損害及修復(fù)情況

中藥治療60天后，耳蝸第一回毛細(xì)胞缺失減少，存活的細(xì)胞密度增加(圖2a)，耳蝸第二回和第三回的增殖細(xì)胞出現(xiàn)較多，同時存活的毛細(xì)胞亦增多(圖2b、c)。而致聾后對照組耳蝸第一回和第二回毛細(xì)胞基本消失，Corti器僅由移行上皮代替(圖2d、e)，第三回仍有大量的毛細(xì)胞缺失，在缺失處未見增殖細(xì)胞出現(xiàn)(圖2f)。

中藥治療90天后，耳蝸毛細(xì)胞的增殖數(shù)目明顯增多，許多處于中間狀態(tài)的細(xì)胞，其特點是表皮板濃染，在顯微鏡微調(diào)下可以見到完整的靜纖毛束(圖3a～c)，基本可以肯定這些中間細(xì)胞是修復(fù)和再生的毛細(xì)胞。致聾后對照組可見到第一、二回耳蝸毛細(xì)胞基本消失，僅存留個別毛細(xì)胞(圖3d、e)，第三回的第一排外毛細(xì)胞基本消失，第二、三排毛細(xì)胞變性(圖3f)。

2.4耳蝸毛細(xì)胞計數(shù)結(jié)果 致聾后中藥治療組治療90天后，可見耳蝸基底回約50%以上的外毛細(xì)胞正常存活,約占耳蝸觀察數(shù)的66.67%(2/3)，第二和第三回的存留毛細(xì)胞中還存在許多處于中間狀態(tài)的毛細(xì)胞，表現(xiàn)為表皮板染色較正常毛細(xì)胞深，可能是由于微絨毛著色的緣故，但其上的靜纖毛束存在和完整，完全不同于修復(fù)的毛細(xì)胞(修復(fù)的毛細(xì)胞最大特點是表皮板仍腫脹凸起)。而致聾后對照組耳蝸基底回平均僅20%左右的外毛細(xì)胞存活，大多數(shù)耳蝸基底回內(nèi)外毛細(xì)胞完全缺失，Corti器基本萎縮消失，并由大量的移行上皮覆蓋，約占耳蝸觀察數(shù)的66.67%，且嚴(yán)重變性的毛細(xì)胞較多(圖4)。說明治療組有毛細(xì)胞修復(fù)和再生。兩組動物的第三回和頂回的存活毛細(xì)胞差異較小，因為慶大霉素主要損害耳蝸的基底回。

2.5掃描電鏡觀察結(jié)果 致聾后中藥治療30天56號豚鼠的耳蝸第二回掃描電鏡觀察顯示，毛細(xì)胞消失處的支持細(xì)胞增殖，表面微絨毛出現(xiàn),在微絨毛的中間出現(xiàn)較粗的纖毛(圖5a、c)是再生毛細(xì)胞的早期表現(xiàn)。在耳蝸第三回的外毛細(xì)胞消失處，掃描電鏡可以清楚的看到具有小束樣的纖毛束，其周圍生長著許多微絨毛(圖5b、d),這是正在發(fā)育成熟的再生毛細(xì)胞。

致聾后對照組30天，耳蝸毛細(xì)胞損害處有空洞和瘢痕出現(xiàn)，存留的外毛細(xì)胞有胞漿外溢、纖毛散亂和融合，并且消失的毛細(xì)胞較多(圖6)。

致聾后對照組90天耳蝸掃描電鏡觀察，可見耳蝸第一回毛細(xì)胞基本消失，第二、三回的外毛細(xì)胞消失較多，在毛細(xì)胞消失部位，可以看到支持細(xì)胞增殖，但表面的微絨毛較少，未見到新生的纖毛樣凸起(圖7)。

致聾后中藥治療組90天后，在57號豚鼠的耳蝸頂回可以看到成熟的再生毛細(xì)胞，其最大特點是靜纖毛束完整，表皮板上覆蓋著微絨毛，這與鄰近的存留毛細(xì)胞具有光滑的表皮板形成明顯差異(圖8a、d)。在耳蝸第三回的毛細(xì)胞間亦出現(xiàn)小束樣的纖毛束(圖8b、e)，而耳蝸第二回的毛細(xì)胞消失部位僅出現(xiàn)正在增殖生長的支持細(xì)胞，其表面亦覆蓋著微絨毛(圖8c、f)。

毛細(xì)胞再生增殖早期、中期和成熟的過程見圖9。

圖4 慶大霉素致聾后中藥治療90天豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞正常存活的百分?jǐn)?shù)與致聾后對照組比較

圖6 慶大霉素致聾后30天致聾后對照組耳蝸毛細(xì)胞損害的掃描電鏡觀察

圖7 慶大霉素致聾后對照組豚鼠90天后耳蝸毛細(xì)胞增殖與修復(fù)的掃描電鏡觀察

圖8 57號豚鼠慶大霉素致聾后治療90天耳蝸毛細(xì)胞再生掃描電鏡觀察

圖9 慶大霉素致聾后中藥治療90天耳蝸支持細(xì)胞增殖為新生毛細(xì)胞前期表現(xiàn)的掃描電鏡觀察

3 討論

倪月秋[1]的實驗結(jié)果表明, GM 耳中毒后1天動物耳蝸第二回外毛細(xì)胞纖毛產(chǎn)生融合、扭曲、倒伏、缺失或殘缺不全等病理現(xiàn)象, 內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛外側(cè)有囊狀突出物，推測該囊狀突出物可能源于內(nèi)毛細(xì)胞, 因為一般在毛細(xì)胞代謝紊亂和壞死之前, 通?？梢娂?xì)胞內(nèi)容物自表皮板排出, 其原因可能與溶酶體的異溶和自溶功能有關(guān)；豚鼠GM中毒后30天，耳蝸第三回外毛細(xì)胞可見纖維的纖毛束，明顯不同于原有的靜纖毛，提示GM中毒后耳蝸毛細(xì)胞具有一定程度的再生修復(fù)能力。本實驗中同樣觀察到GM致聾后豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的病理改變，致聾后治療組亦見到Corti器上纖細(xì)的纖毛束，在掃描電鏡觀察下，這些纖細(xì)和較小的纖毛束明顯不同于存留的毛細(xì)胞，并且可以看到單根的纖毛和成小束的纖毛束。而本實驗中GM致聾后對照組30天后豚鼠ABR反應(yīng)閾雖有所恢復(fù), 但與正常對照組相比差異顯著 , 同時耳蝸第二回外毛細(xì)胞靜纖毛融合、缺失、倒伏等病理改變減弱, 明顯不同于剛受損的毛細(xì)胞, 內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛與正常對照組相比未見明顯差異, 第三回外毛細(xì)胞可見纖細(xì)的纖毛束, 明顯不同于原有的靜纖毛, 提示GM 中毒后耳蝸毛細(xì)胞具有一定程度的再生修復(fù)能力。

劉冰等[2]在GM 耳中毒后豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷與再生的實驗中證明存活4周者微絨毛密集, 但不規(guī)則, 未發(fā)現(xiàn)不成熟的小纖毛束。本實驗中GM致聾后治療組中藥治療后，毛細(xì)胞缺失處的支持細(xì)胞表面微絨毛密集，早期的微絨毛雖然密集，但長度較短(治療30天)，中期時(治療60天)微絨毛密度更大且長度更長，在治療后期時(治療90天)基本呈現(xiàn)出小纖毛束的雛形。

沈嘯洪等[3]給豚鼠肌肉注射卡那霉素致聾后，治療組用中藥補腎聰耳片治療10天，結(jié)果，未經(jīng)治療的對照組耳蝸螺旋器毛細(xì)胞損害嚴(yán)重, 以外毛細(xì)胞為甚, 內(nèi)毛細(xì)胞損害較輕, 外毛細(xì)胞第一回聽毛損害較重, 第二回次之, 第三回較輕, 表現(xiàn)排列紊亂, 聽毛倒伏, 扭曲變形, 指向不同方向, 嚴(yán)重者有聽毛脫落、缺損, 甚至大片脫落, 基底膜亦有不同程度損壞, 未見到修復(fù)現(xiàn)象；而治療組多數(shù)毛細(xì)胞聽毛排列整齊, 極少數(shù)聽毛倒伏紊亂、 扭曲變形, 缺損比對照組明顯減少, 基底膜恢復(fù)完整, 亦可見到絨纖毛, 表明聽毛細(xì)胞有修復(fù)現(xiàn)象。而本研究中致聾后治療組60和90天的絨纖毛細(xì)胞更多和更全面，并且發(fā)現(xiàn)了再生成熟的毛細(xì)胞(圖9)，同時動物DPOAE和ABR均有恢復(fù)，說明中藥制劑復(fù)聰湯能促進耳蝸毛細(xì)胞修復(fù)和再生。

侯建平等[4]的實驗中，耳蝸鋪片顯示單用卡那霉素后動物外毛細(xì)胞損害較嚴(yán)重, 耳蝸底回外毛細(xì)胞缺失率為57. 5%, 而服用茯苓治療10天后動物耳蝸底回外毛細(xì)胞缺失率為39. 6%，說明茯苓可減輕卡那霉素中毒性耳蝸損害。本研究中，致聾后治療組豚鼠的耳蝸基底回約50%以上的外毛細(xì)胞正常存活,占耳蝸觀察數(shù)的66.67%(2/3)，耳蝸第二和第三回的存留毛細(xì)胞中，還存在許多處于中間狀態(tài)的毛細(xì)胞，而致聾后對照組耳蝸基底回平均僅20%左右的外毛細(xì)胞存活，大多數(shù)耳蝸基底回內(nèi)外毛細(xì)胞完全缺失，Corti器基本萎縮消失，并由大量的移行上皮覆蓋，約占耳蝸觀察數(shù)的66.67%，并且嚴(yán)重變性的毛細(xì)胞較多。

無論鳥類耳蝸還是哺乳類動物的前庭器感覺上皮，再生毛細(xì)胞的顯著特征表現(xiàn)在表皮板上的纖毛和細(xì)胞體：首先是表皮板上早期生長出動纖毛和微絨毛，叢生的微絨毛逐漸長高，并逐步出現(xiàn)階梯樣層次結(jié)構(gòu)，此時的動纖毛已消失，而表皮板和靜纖毛束最終發(fā)育完善，生長成正常的毛細(xì)胞[10，11]；第二是看到細(xì)胞體的出現(xiàn)和發(fā)育完善。新生毛細(xì)胞的特點是表皮板中央生長著動纖毛，動纖毛周圍生長著微絨毛，微絨毛的肌動蛋白微絲增粗而長成靜纖毛束[12]。

某些再生毛細(xì)胞的形態(tài)特征主要是具有獨特的毛細(xì)胞特征(靜纖毛) (stereocilia) 并具有支持細(xì)胞的表型(伸長的細(xì)胞體與基底膜相連)。當(dāng)然，這種存在方式并不能證明它是直接轉(zhuǎn)化分化的。諸如此類中間狀態(tài)(intermediate)的細(xì)胞可見于牛蛙[13，14]、雞[15]和豚鼠[16]。這些形態(tài)目前已證明是有絲分裂的毛細(xì)胞[17]。慶大霉素?fù)p害后，非典型細(xì)胞具有頂部特化的微絨毛，類似于早期分化的靜纖毛短暫出現(xiàn)于中毒損傷的耳蝸頂端，但最終分化為毛細(xì)胞。Daudet等[18]應(yīng)用COPIED ABSTR電子顯微鏡 、組織化學(xué)和激光共聚焦顯微鏡，觀察丁胺卡那霉素?fù)p害大鼠耳蝸Corti 器，用BrdU( 5-bromo-2-deoxyuridine)免疫細(xì)胞化學(xué)方法確定有無有絲分裂過程參與非典型細(xì)胞的形成過程 。形態(tài)學(xué)和分子學(xué)資料證明非典型細(xì)胞并不是復(fù)原的毛細(xì)胞，而是未成熟的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，增殖細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)的非典型細(xì)胞，并非是通過細(xì)胞有絲分裂過程而來的。 結(jié)合以前研究結(jié)果，他們支持非典型細(xì)胞是通過某些支持細(xì)胞在毛細(xì)胞退行性改變期直接轉(zhuǎn)化形成的假設(shè)[19]。本研究顯示致聾后治療組豚鼠耳蝸亦發(fā)現(xiàn)許多處于中間狀態(tài)的細(xì)胞，故支持非典型的中間細(xì)胞是再生和修復(fù)的毛細(xì)胞的表現(xiàn)。

本研究選擇的中藥復(fù)聰湯Ⅰ號、復(fù)聰湯Ⅱ號具有滋補肝腎、活血化瘀、益氣開竅、疏通經(jīng)絡(luò)、改善耳蝸內(nèi)循環(huán)之功效，還可能具有促使聽覺毛細(xì)胞再生之功效。從文中結(jié)果看，致聾后中藥治療組使用復(fù)聰湯Ⅰ號和復(fù)聰湯Ⅱ號治療30到90天后，耳蝸受損的毛細(xì)胞有一定程度的修復(fù)和再生，雖然再生毛細(xì)胞的數(shù)目較少，在治療動物中的出現(xiàn)率不是很高，但動物的DPOAE幅值及ABR反應(yīng)閾值均有一定恢復(fù)，表明復(fù)聰湯確實可在一定程度上促使哺乳類動物耳蝸毛細(xì)胞的修復(fù)和再生，并改善損害后的聽功能。該中藥制劑的其它機理和毒副作用尚需進一步深入研究。

毛細(xì)胞再生的研究從魚類、鳥綱類到哺乳動物類[10～12，20]，許多學(xué)者在形態(tài)功能、機制探討等方面作了大量的工作，但到目前為止內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育再生的確切機制仍不十分清楚。再生毛細(xì)胞的生理功能如何，如何與周圍的支持細(xì)胞形成正確的組織結(jié)構(gòu)，如何刺激成年哺乳動物內(nèi)耳中的干細(xì)胞發(fā)育成具有正常生理功能的毛細(xì)胞，能否找到毛細(xì)胞分化和發(fā)育過程中起重要作用的基因和相關(guān)信號分子等問題還需要努力解決，今后的研究重點將會側(cè)重于毛細(xì)胞再生的機制及如何促進再生等研究方向。

4 參考文獻

1 倪月秋,湯浩,崔城.慶大霉素中毒后豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的再生[J].中國病理生理雜志，2004, 20:536.

2 劉冰,李西秦,吳潤身，等. 慶大霉素耳中毒后豚鼠橢圓囊斑和耳蝸毛細(xì)胞損傷與再生的觀察[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 1998, 33:184.

3 沈嘯洪，林文森.補腎聰耳片對卡那霉素致聾豚鼠聽毛細(xì)胞修復(fù)研究[J].天津醫(yī)藥， 2004,32:38.

4 候建平， 劉耀春， 劉桂英.茯苓與豚鼠卡那霉素耳中毒[J].中醫(yī)藥研究，1997,13：45.

5 倪月秋.中藥對氨基糖苷類抗生素致聾耳蝸毛細(xì)胞再生修復(fù)影響的研究進展[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010 ，12 ：193.

6 崔城，湯浩，李煜興，等.川芎嗪對慶大霉素耳中毒耳蝸外毛細(xì)胞和血管紋的保護作用[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2002，10：258.

7 徐紹勤，毆陽林，曾省三，等.復(fù)聰片對豚鼠慶大霉素耳中毒的防治作用[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10：341.

8 鐘渠，鄭桃曉，馮志榮，等.聰耳合劑治療感音神經(jīng)性耳聾隨機對照研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011,29：1 752.

9 陳奇，主編.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993.1 167～1 170.

10 李勝利，朱宏亮，白秦生.慶大霉素和卡那霉素耳中毒后雛雞耳蝸毛細(xì)胞再生[J].中華耳鼻咽喉科雜志，1997,29：89.

11 李勝利，朱宏亮，白秦生.氨基糖甙類抗生素?fù)p害雞耳蝸后前庭毛細(xì)胞再生及耳石體修復(fù)[J].臨床耳鼻咽喉科雜志，1994,8：102.

12 李勝利，張正民，張少強，等.蝙蝠耳蝸毛細(xì)胞損害后支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為再生毛細(xì)胞研究[J].中華耳科學(xué)雜志，2010, 8：335.

13 Baird RA, Burton MD, Fashena DS, et al. Hair cell recovery in mitotically blocked cultures of the bullfrog saccule[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97:11 722.

14 Steyger PS, Burton M, Hawkins JR, et al. Calbindin and parvalbumin are early markers of non-mitotically regenerating hair cells in the bullfrog vestibular otolith organs[J]. Int J Dev Neurosci,1997,15:417.

15 Hirose K, Westrum LE, Stone JS, et al. Dynamic studies of ototoxicity in mature avian auditory epithelium[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,1999,884:389.

16 Li L, Forge A. Morphological evidence for supporting cell to hair cell conversion in the mammalian utricular macula[J]. Int J Dev Neurosci,1997,15:433.

17 Stone JS, Rubel EW. Cellular studies of auditory hair cell regeneration in birds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000a,97:11 714.

18 Daudet N, Vago P, Ripoll C, et al. Characterizaton of atypical cells in the juvenile rat organ of corti after aminoglycoside ototoxity[J]. The Journal of Comparative Neurology ，1998，401:145.

19 Cafaro J, Lee GS, Stone JS. Atoh1 expression defines activated progenitors and differentiating hair cells during avian hair cell regeneration[J]. Dev Dyn,2007,236:156.

20 李勝利，朱宏亮.慶大霉素耳中毒后毛細(xì)胞再生的超微結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997,18：381.