酰胺酶高通量篩選方法研究進(jìn)展

田慧，鄭仁朝，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院生物工程研究所，浙江杭州310014)

酰胺酶(Amidase，EC 3.5.1.4)是一類(lèi)催化酰胺C-N鍵水解生成相應(yīng)羧酸和氨的重要生物催化劑。該酶促反應(yīng)的本質(zhì)是催化酰基從其供體(底物酰胺)向受體(如共底物水)的轉(zhuǎn)移［1］。因此，當(dāng)體系中存在比水更強(qiáng)的親核試劑如羥胺或肼為受體時(shí)，可生成氧肟酸或酰基肼［2-3］(圖1)，酰胺酶底物譜極廣，能高效催化各種非天然脂肪族、雜環(huán)族及芳香族酰胺的水解［4-5］，并具有高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性和不需輔酶等優(yōu)點(diǎn)。大量研究表明，在其與腈水合酶(Nitrile hydratase，EC 4.2.1.84)耦聯(lián)的腈立體選擇性生物轉(zhuǎn)化中，手性識(shí)別行為決定于酰胺水解步驟［6］。酰胺酶對(duì)映選擇性生物催化在復(fù)雜結(jié)構(gòu)手性羧酸、氧肟酸及酰胺衍生物的合成中顯示出巨大潛力，成為手性生物催化的重要工具酶。對(duì)于特定的生物催化過(guò)程，合適、高效的生物催化劑，尤其是立體選擇性生物催化劑的發(fā)現(xiàn)是最為關(guān)鍵的一步。這是因?yàn)橐环矫嬗脗鹘y(tǒng)的基于手性GC或HPLC的篩選方法，去逐一測(cè)定“海量”樣品的活性及立體選擇性十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力。另一方面，隨著蛋白分子改造技術(shù)的快速發(fā)展，突變文庫(kù)包含的突變體數(shù)量巨大(通常含104～106個(gè)突變子)，對(duì)快速、準(zhǔn)確的高通量(High-throughput screening，HTS)酰胺酶篩選模型的建立提出了更為迫切的要求。一個(gè)成功的高通量篩選方法需滿足以下條件:準(zhǔn)確、快速和廉價(jià)［7］。本文綜述了近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酰胺酶高通量篩選技術(shù)，為酰胺酶這一重要生物催化劑的發(fā)現(xiàn)提供借鑒。

圖1 酰胺酶催化的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)(分別以水、羥胺和肼為?；荏w)Fig.1 Acyl transfer reactions catalyzed by amidase(water，hydroxylamine and hydrazine as acyl acceptor)

1 酰胺酶高通量篩選模型建立的基本思路

高通量篩選模型一般都是根據(jù)酶活測(cè)定方法建立起來(lái)的，而酶活測(cè)定方法又建立在酶反應(yīng)產(chǎn)物的相關(guān)特性基礎(chǔ)上。對(duì)于酰胺酶，可以根據(jù)其催化酰胺水解生成羧酸和氨［8］或催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)生成氧肟酸和氨［9］建立相應(yīng)的酶活檢測(cè)方法(圖2)。如可用HPLC、GC等方法直接測(cè)定酰胺的消耗或羧酸的生成來(lái)測(cè)定酶活及光學(xué)選擇性，或根據(jù)反應(yīng)前后電導(dǎo)率的不同檢測(cè)酶活。由于反應(yīng)產(chǎn)物中含NH3，可用比色法和熒光法檢測(cè)酶活。此外，還可根據(jù)氧肟酸在酸性條件下特異性地與Fe3+形成棕褐色復(fù)合物的特性進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖2 檢測(cè)產(chǎn)物的生成或底物的減少來(lái)測(cè)定酰胺酶的活性Fig.2 Determination of products formed and substrates reduced in a amidase-catalyzed reaction

2 高通量酰胺酶篩選模型

2.1 基于NH3的顯色、熒光反應(yīng)

Pan等［10］建立了一種簡(jiǎn)單、快速、微量的奈斯勒試劑顯色法，可直接從平板上篩選出產(chǎn)L-門(mén)冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASP)的菌株。其原理是利用該酶催化產(chǎn)生的NH3與奈斯勒試劑作用后生成棕紅色碘化雙汞銨絡(luò)合物，可借助比色法進(jìn)行定量測(cè)定。彭中建等［11］利用此方法成功選育高產(chǎn)L-門(mén)冬酰胺酶和性狀穩(wěn)定的大腸埃希菌突變株。氨與鄰苯二醛及亞硫酸鹽可生成熒光復(fù)合物(圖3)。雖然目前還不清楚該化合物的精確結(jié)構(gòu)，但該方法已經(jīng)成功地用于酰胺酶活性的檢測(cè)［12］。Genfa等［13］借助微量滴定板熒光讀數(shù)器篩選能水解α-H-α-氨基酰胺的酰胺酶，從2 880個(gè)樣品中快速篩選到8個(gè)活性較好的酰胺酶。

圖3 氨的鄰苯二醛/亞硫酸鹽衍生反應(yīng)Fig.3 Derivatization reaction of ammonia with o-phthalaldehyde and sulfite

谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，EC 1.4.1.3，GDH)可催化NH3與α-酮戊二酸生成L-谷氨酸，同時(shí)NAD(P)H氧化為NAD(P)+(圖4)。NAD(P)H的氧化可在340 nm下定量檢測(cè)。Sonke等［14］利用此方法篩選氨基酸酰胺消旋酶，通過(guò)待檢測(cè)樣品與光學(xué)選擇性酰胺酶聯(lián)合使用，從11 272個(gè)大腸埃希菌克隆中篩選到32個(gè)陽(yáng)性克隆。

圖4 谷氨酸脫氫酶GDH氨檢測(cè)法原理Fig.4 The principle of Glutamate dehydrogenase(GDH)to detect ammonia

由于微生物培養(yǎng)基中通常含有酵母提取物和蛋白胨，微生物生長(zhǎng)時(shí)會(huì)利用肽和氨基酸生成氨，導(dǎo)致使用上述高通量篩選方法時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的背景干擾［12］。因此，實(shí)際使用時(shí)要通過(guò)離心收獲細(xì)胞，緩沖液洗滌等步驟盡量減少干擾。

2.2 熒光法

Ramarao等［15］建立了熒光法脂肪酸酰胺酶(Fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)高通量篩選技術(shù)。其原理是將熒光素連接在底物上，此時(shí)熒光被淬滅。在脂肪酸酰胺酶作用下，生成花生四烯酸和熒光素，熒光素重新釋放產(chǎn)生熒光(圖5)。

圖5 熒光快速檢測(cè)脂肪酸酰胺酶FAAH活性的原理Fig.5 The principle of fluorescence method for rapid detection the FAAH activity

Henke等［16］利用酰胺酶催化水解產(chǎn)生的胺類(lèi)物質(zhì)經(jīng)4-氯-7-硝基苯并-2-氧氯-1，3-二唑(NBD-Cl)衍生化生成熒光染料容易檢出的原理，建立了高通量篩選模型(圖6)。該方法的不足是不能用于篩選氨基酰胺酶，因?yàn)榈孜锇被０繁旧硪彩怯坞x胺，也會(huì)被衍生化。

圖6 胺類(lèi)物質(zhì)衍生化生成熒光染料反應(yīng)式Fig.6 Reaction of derivatization amine to fluorescent dyes

酰胺酶可以催化氨基酰胺生成相應(yīng)的氨基酸，氨基酸是很強(qiáng)的金屬離子(特別是Cu2+)螯合劑，而氨基酰胺則無(wú)絡(luò)合能力。伯爾尼大學(xué)的Dean等［17］利用銅的大環(huán)螯合物作為熒光指示劑，建立了氨基酸酰胺酶篩選模型(圖7)。該方法的原理是Cu2+易與商品化的熒光素形成復(fù)合物，此時(shí)熒光素的熒光基團(tuán)被Cu2+淬滅。而酰胺酶催化產(chǎn)物氨基酸能夠更強(qiáng)烈地螯合Cu2+，重新釋放熒光素，使其重獲熒光。

2.3 基于氧肟酸與Fe(Ⅲ)的螯合特性

Zheng等［9］基于酰胺酶的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物氧肟酸與鐵離子在酸性條件下螯合顯色特性，建立了高通量立體選擇性酰胺酶篩選模型(圖8)。從523株菌種中篩選得到2株能夠R-選擇性水解2，2-二甲基環(huán)丙甲酰胺的酰胺酶產(chǎn)生菌。該方法與現(xiàn)有的基于底物官能團(tuán)特性的酰胺酶篩選模型相比，其更顯著的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)底物的普適性。

2.4 基于產(chǎn)物氨基酸與銅離子的螯合作用

Duchateau等［18］用Cu2+作為金屬指示劑進(jìn)行氨基酸酰胺酶活性的比色法檢測(cè)，成功地用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化α-甲基纈氨酸酰胺為α-甲基纈氨酸的酰胺酶活性(圖9)。此方法的依據(jù)是堿性環(huán)境下α-氨基酸及其相應(yīng)的氨基酰胺與Cu(Ⅱ)形成的復(fù)合物在光譜特性上的差異，當(dāng)pH＞8時(shí)，底物和產(chǎn)物即與Cu2+形成了不同顏色的絡(luò)合物，Cu2+只作為金屬指示劑。這有別于早期使用Cu2+或Ni2+作為金屬指示劑并與大環(huán)的熒光金屬螯合劑聯(lián)用的方法。此方法的缺點(diǎn)是只適用于氨基酸酰胺酶的篩選，同時(shí)在堿性條件下影響酶活檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

圖7 銅配合物檢測(cè)氨基酸的熒光法原理Fig.7 Principle of fluorescence assay for amino acid using copper-ligand complexes

圖8 立體選擇性酰胺酶篩選模型構(gòu)建機(jī)理與篩選實(shí)例Fig.8 The mechanism and examples of the colorimetric screening method for enantioselective amidase

圖9 基于Cu2+與氨基酸絡(luò)合反應(yīng)的氨基酸酰胺酶篩選模型Fig.9 The model for screening amino acid amidase based on the Cu2+-complexed amino acid

2.5 基于瓊脂平板顯色法

利用過(guò)氧化物酶能夠與D-氨基酸氧化酶作用產(chǎn)物過(guò)氧化氫發(fā)生反應(yīng)并將其轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物的原理，建立了一種基于瓊脂平板顯色法的酰胺酶篩選模型。Komeda等［19］定向進(jìn)化Ochrobactrum anthropi SV3 D-氨基酸酰胺酶，通過(guò)該法對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選。將硝酸纖維膜上的菌落浸泡在含有底物D-苯丙氨酸酰胺、苯酚、D-氨基酸氧化酶、過(guò)氧化物酶和4-氨基安替比林的溶液中，挑出產(chǎn)生粉紅/紅色的菌落，最終篩到2個(gè)陽(yáng)性突變株，其相對(duì)野生型酰胺酶的Vmax約提高了3倍，而表觀Km值幾乎不變。

2.6 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)法篩選酰胺酶

NMR波譜是一種完善的分析技術(shù)，能夠直接檢測(cè)分子結(jié)構(gòu)并進(jìn)行定量。由于酶促反應(yīng)中的底物和產(chǎn)物通常是具有不同磁性的化學(xué)個(gè)體，產(chǎn)生不同的NMR波譜。同時(shí)由于NMR波譜的定量性質(zhì)，可通過(guò)測(cè)定底物和產(chǎn)物的量來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，測(cè)量速度大大加快，如今H-NMR已經(jīng)能夠適用于各種酶的中/高通量篩選。

Sonke等［20］用該方法篩選能水解D，L-α-甲基亮氨酸酰胺的酰胺酶，共篩選了120個(gè)微量滴定板(共11 520個(gè)樣品)，最終獲得2個(gè)陽(yáng)性克隆。另外，通過(guò)易錯(cuò)PCR、DNA shuffling等定向進(jìn)化技術(shù)，Bovenberg等［21］使O.anthropi NCIMB40321 L-酰胺酶對(duì)DL-α-甲基苯基甘氨酰胺的比活提高了約5倍。

3 討論

本文較為詳細(xì)地介紹了近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高通量酰胺酶篩選方法及應(yīng)用。這些方法的建立大大加快了酰胺酶的篩選速度，為從自然環(huán)境和突變文庫(kù)中獲得符合要求的酰胺酶提供了有效手段?？偟膩?lái)說(shuō)，基于顯色或熒光的高通量體系應(yīng)用最為廣泛。但是，篩選過(guò)程的重要原則之一是“獲得目的菌株”，這些方法又通常經(jīng)過(guò)發(fā)色團(tuán)等基團(tuán)的衍生化，篩選結(jié)果并不能完全代表酶對(duì)真實(shí)底物的活性和立體選擇性。因此，在高通量篩選方法的構(gòu)建過(guò)程中，保證底物的真實(shí)性是必須注意的問(wèn)題。

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