李燕，崔杰鑫，趙文

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省水生生物重點(diǎn)實(shí)驗室，遼寧大連116023)

近年來，刺參養(yǎng)殖業(yè)走上發(fā)展的快車道，迅速成為高經(jīng)濟(jì)效益的產(chǎn)業(yè)［1］，刺參的養(yǎng)殖密度也越來越高。過高的養(yǎng)殖密度給養(yǎng)殖水體帶來了氮元素輸入和產(chǎn)出的嚴(yán)重不平衡，導(dǎo)致水體氨態(tài)氮，亞硝酸態(tài)氮大量積累［2］。養(yǎng)殖水體中高濃度的氮元素極易引發(fā)刺參的病害和死亡，也嚴(yán)重破壞了養(yǎng)殖系統(tǒng)的氮循環(huán)平衡體系［3］。如何有效控制養(yǎng)殖水體的氮污染一直是水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的重要問題之一，目前研究較多的是采用微生物方法［4-5］。本文綜述了氨氮的危害、微生物對降解氨氮和微生物降解法的實(shí)際應(yīng)用，并對該方法的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 氨態(tài)氮對刺參的毒害

我國的刺參養(yǎng)殖多采用封閉式，隨著養(yǎng)殖時間的增加，刺參的糞便、殘餌、其他生物的排泄物以及一些浮游動植物的尸體不斷在池塘底部積累，富集在池底的這些污染物在一定條件下會向養(yǎng)殖水體中釋放無機(jī)氮如N、NO2--N，尤以-N的毒性為最大［3，6-7］。氮污染對刺參的毒性機(jī)制還不是很清楚，一般比較認(rèn)同的解釋是:氨態(tài)氮能通過刺參體表深入機(jī)體內(nèi)，釋放OH-，促使體液pH升高，對酶水解反應(yīng)和膜穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響，表現(xiàn)為呼吸困難、不攝食、抵抗力下降等現(xiàn)象導(dǎo)致刺參大批量死亡［8］;認(rèn)為高濃度的氨態(tài)氮會取代刺參體內(nèi)的鉀離子，影響神經(jīng)系統(tǒng)工作，引起N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合活性明顯降低，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中流入過量的鈣離子并引起細(xì)胞死亡［9］。刺參生活過程中也會以氨態(tài)氮的形式向環(huán)境中排泄氮元素，當(dāng)外界水環(huán)境氨態(tài)氮含量過高時會抑制刺參的排泄，進(jìn)而影響其自身的生長。

2 微生物對氨態(tài)氮的降解

微生物脫氮技術(shù)能夠有效去除刺參養(yǎng)殖池塘中高含量的氮元素，具有十分重要的意義和極大的實(shí)用價值，尤其是在降解池塘氨態(tài)氮方面作用更大［10］。在養(yǎng)殖池塘中，微生物降解氨態(tài)氮過程主要發(fā)生在沉積物中，這個過程占據(jù)了整個養(yǎng)殖池塘氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟［11］。微生物降解氨態(tài)氮的過程主要由兩大類細(xì)菌完成:自養(yǎng)硝化細(xì)菌和異養(yǎng)硝化細(xì)菌。自養(yǎng)硝化細(xì)菌將水體中氨態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}態(tài)氮和硝酸態(tài)氮，并從該氧化過程中獲得能量，同化無機(jī)碳化合物CO32-、HCO3-和CO2，合成細(xì)胞物質(zhì)［10］。自養(yǎng)硝化細(xì)菌降解氨態(tài)氮分2個相對獨(dú)立而又聯(lián)系緊密的階段。前一階段NH3氧化為NO2-，成為亞硝化作用或氨氧化作用，由亞硝化細(xì)菌完成;后一階段是NO2-氧化為NO3-的過程，稱為硝化作用，由硝化細(xì)菌完成。所以，常說的硝化作用實(shí)際上包括了上述2個階段［11-12］。異養(yǎng)硝化細(xì)菌在某些特定的環(huán)境中進(jìn)行化能異養(yǎng)，能分別將氨態(tài)氮和亞硝酸鹽等氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽。異養(yǎng)硝化細(xì)菌可利用的氮源比較多，包括無機(jī)氮(NH3、NO2-)和有機(jī)氮(胺、酰胺、N-烷基羥胺、芳香硝基化合物等)，這是異養(yǎng)硝化細(xì)菌不同于自養(yǎng)硝化細(xì)菌的特點(diǎn)之一。正因為異養(yǎng)硝化細(xì)菌可以利用的氮源比較多，所以異養(yǎng)硝化作用的底物及其代謝途徑至今仍不太清楚［10］。

3 高效氨氮降解菌株的篩選、鑒定和固定

自養(yǎng)硝化細(xì)菌生長緩慢，代謝周期較長，無法在有機(jī)物含量高的刺參池塘底泥中和異養(yǎng)菌競爭，這導(dǎo)致自養(yǎng)硝化細(xì)菌難以形成優(yōu)勢種群。同時，自養(yǎng)硝化細(xì)菌對外界環(huán)境的變化適應(yīng)能力差，尤其對外界毒性沖擊敏感，一旦自養(yǎng)硝化細(xì)菌的降解體系受到損害很難恢復(fù)［2，13］。因此，對水體環(huán)境要求高，生長速度緩慢，生物量小，難以快速處理水質(zhì)急劇惡化問題，是自養(yǎng)硝化細(xì)菌難以在刺參養(yǎng)殖池塘的氨態(tài)氮降解上發(fā)揮重要作用的主要原因［14］。在降解養(yǎng)殖水體氨態(tài)氮方面，異養(yǎng)硝化細(xì)菌有其獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，異養(yǎng)硝化細(xì)菌生長速率快，能在短時間內(nèi)成為池塘微生物生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢種群，利用水體中的氨態(tài)氮［10］。其次，異養(yǎng)硝化細(xì)菌成為微生物生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢種群后還能夠與致病菌競爭空間、營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生胞外產(chǎn)物抑制病原菌的生長［14-16］。因此，如何篩選高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌來降解養(yǎng)殖水體氨態(tài)氮成了近年來的研究課題。

3.1 高效降解菌株的來源

研究發(fā)現(xiàn)，某些陸生動物使用的益生菌可以應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖［17］，但大部分學(xué)者認(rèn)為，從刺參或其周圍養(yǎng)殖環(huán)境中篩選的降解氨態(tài)氮的降解微生物是比較好的候選微生物［14，18］。目前，刺參養(yǎng)殖過程中使用的有降解氨態(tài)氮功能的益生菌多為外來菌株，大量使用將有可能導(dǎo)致外來菌種的入侵，破壞養(yǎng)殖池塘底部原本脆弱的微生物生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)其他病害。

3.2 高效降解菌株的篩選

對于任何一種具有降解氨態(tài)氮功能的有益微生物的篩選，如果篩選方法得當(dāng)，可以大大減少篩選的工作量，并且不會發(fā)生漏選的問題［19］。對采集樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)是微生物分離的關(guān)鍵步驟之一，其目的是淘汰樣品中競爭能力和生命力弱的菌株，擴(kuò)大具有強(qiáng)競爭能力菌株的生物量以方便復(fù)篩。淘汰樣品中競爭能力弱的菌株可以保證篩選出的菌株應(yīng)用于養(yǎng)殖水環(huán)境后發(fā)揮自身的競爭優(yōu)勢，通過營養(yǎng)競爭等快速繁殖以達(dá)到去除水體氨態(tài)氮的目的［20］。在一種候選菌被用做高效降解菌進(jìn)行工廠化生產(chǎn)之前，有必要證實(shí)其對養(yǎng)殖生物沒有毒害。因此，應(yīng)在正常養(yǎng)殖條件下，用候選的高效降解菌對養(yǎng)殖生物進(jìn)行攻毒實(shí)驗，在確定其無致病性后，再進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，這是評價該菌株效果是否最佳的有效方法［16］。由于實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境中池塘底質(zhì)各種物質(zhì)含量和實(shí)驗室培養(yǎng)基相差很大，實(shí)驗室的環(huán)境條件和養(yǎng)殖環(huán)境差別也很大，這些都為候選微生物發(fā)揮降解作用增加了困難。所以，在實(shí)驗室條件下篩選得到氨態(tài)氮高效降解菌株后有必要進(jìn)行養(yǎng)殖環(huán)境的復(fù)篩［21］。

3.3 高效降解菌株的鑒定

一般來說，細(xì)菌的鑒定至少需要使用3種指標(biāo)同時進(jìn)行驗證。傳統(tǒng)的生理生化方法鑒定微生物需要測定的項目眾多，工作程序繁瑣，耗時長。分子生物學(xué)方法進(jìn)行細(xì)菌鑒定速度快、工作量小，該方法雖然通過了相關(guān)權(quán)威組織的認(rèn)可，但其穩(wěn)定性尚存在一些問題，同時需要配合其他方法來相互印證，從而完成細(xì)菌的鑒定工作。所以，采用傳統(tǒng)的生理生化方法和現(xiàn)代的分子生物學(xué)方法相結(jié)合來鑒定氨態(tài)氮高效降解菌株是比較科學(xué)的方法［22］。

3.4 高效降解菌株的固定

由于刺參的糞便、殘餌、其他生物的排泄物以及一些浮游動植物的尸體不斷在池塘底部積累，所以池塘底部是養(yǎng)殖水體中氨態(tài)氮的主要產(chǎn)生場所;另外，池塘底部積累的大量有機(jī)物和營養(yǎng)元素為有害微生物的繁殖提供了營養(yǎng)，這些有害微生物的大量繁殖使刺參生活在一個不健康的環(huán)境中，容易發(fā)生病害［11，18］。如果將微生態(tài)制劑直接施用到池塘底部，不僅可以在氨態(tài)氮濃度最高的地方將其利用掉，還能在菌株大量繁殖時抑制有害微生物的繁殖。固定后的高效降解菌株與傳統(tǒng)的懸浮微生物處理法相比降解效率更高［23］，而且固定后的降解菌株不容易隨著池塘換水而流失，也提高了菌株對環(huán)境(pH、溫度、有毒物質(zhì)等)的抗沖擊能力［24］。

通過聚乙烯醇、海藻酸鈉、交聯(lián)樹脂等多聚體化合物將具有降解功效的細(xì)菌包埋，其內(nèi)部空間具有氧擴(kuò)散能力，可以提高菌的降解功效和生長速度［24］。謝冰等［24］研究了海藻酸鈉-氯化鈣方法、聚乙烯醇硼酸法和聚乙烯醇冷凍-解凍法固定硝化細(xì)菌后的硝化速率發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉-氯化鈣方法固定的硝化細(xì)菌的硝化速率明顯高于其他2種方法，而且海藻酸鈉-氯化鈣方法的制備過程操作簡單。選擇開發(fā)性能更加優(yōu)良的固定化載體、反應(yīng)器中最佳的細(xì)菌投加量、在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定可靠性以及如何工廠化生產(chǎn)將是今后氨態(tài)氮降解菌株固定化的研究方向［25］。

4 氨氮降解菌株的應(yīng)用現(xiàn)狀

閆法軍等［18］從刺參養(yǎng)殖池塘中分離篩選得到1株低溫氨氮降解菌株，鑒定為馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)，該菌株在低溫(15℃)、低接種量(＜5×10-3)條件下5 d后對富集培養(yǎng)基中氨態(tài)氮的降解率高達(dá)98%;經(jīng)馴化后對1～20 g/L質(zhì)量濃度的刺參餌料液中氨態(tài)氮3 d時間的去除率達(dá)91.7%～99.9%。陸錦天和李?。?6］研究了生物凈水劑對南美白對蝦苗種池亞硝酸鹽含量的影響，向池中施用硝化細(xì)菌、芽胞桿菌等生物凈水劑，池水中亞硝酸鹽含量由1.0 mg/L下降至0.1 mg/L，且沒有出現(xiàn)反彈。李卓佳等［27］采用以芽胞桿菌屬菌株為主導(dǎo)的復(fù)合制劑，在養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦的池塘中進(jìn)行了3個月的實(shí)驗，結(jié)果表明，實(shí)驗組與對照組相比，氨氮降低了5%以上，溶解氧增加了30%～100%，斑節(jié)對蝦的產(chǎn)量分別提高了50.3%和87.9%。

雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已有很多使用微生物來降解水體氨氮、亞硝酸鹽和調(diào)節(jié)水質(zhì)的大量報道，但還存在很多問題需要解決:①菌種在人工培育若干代后會出現(xiàn)形態(tài)、生化甚至是降解特性的變化，大多生產(chǎn)企業(yè)沒有很好地監(jiān)控細(xì)菌變異的問題，導(dǎo)致生產(chǎn)的成品出現(xiàn)質(zhì)量問題，有可能把致病菌引入養(yǎng)殖環(huán)境中。Wang等［28］曾報道在養(yǎng)殖草蝦中發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)菌性白斑病(BWSS)，懷疑是因大量使用含有枯草芽胞桿菌的益生菌產(chǎn)品所致;②養(yǎng)殖過程中仍然在大量使用廣譜殺菌消毒劑和抗生素，當(dāng)降解菌株與這些藥物交叉使用時，大部分的菌株也被殺死，而不能在養(yǎng)殖池塘中建立穩(wěn)定、有益的微生物群，導(dǎo)致降解菌株收效甚微;③高效氨態(tài)氮降解菌株工廠化生產(chǎn)后，產(chǎn)品中活菌受溫度、環(huán)境氧濃度、光照、濕度等因素影響，在儲存過程中活菌濃度逐漸下降。而且，產(chǎn)品中菌的濃度和固定劑的特性有很大關(guān)系。因此，如何保證產(chǎn)品到達(dá)施用地后仍保持較高的活菌濃度和尋找更加合適的固定劑成為當(dāng)前氨態(tài)氮降解菌株工廠化生產(chǎn)的主要難題;④由于微生物之間具有復(fù)雜的協(xié)同作用，如何將各種降解菌株合理搭配、優(yōu)化組合制造出更加高效的復(fù)合菌制劑產(chǎn)品還需要深入研究以及廣泛的實(shí)踐檢驗［29］。

5 氨氮降解菌株的實(shí)際應(yīng)用現(xiàn)狀

在池塘養(yǎng)殖過程中，為刺參提供一個低氨態(tài)氮的水環(huán)境和有益微生物群落是刺參健康、快速生長的前提。傳統(tǒng)方法去除養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮和預(yù)防疾病的方法會破壞養(yǎng)殖池塘中的微生物生態(tài)平衡，因此，使用從池塘分離篩選具有降解氨態(tài)氮功效的益生菌來降低池塘水體氨態(tài)氮具有很大的潛力。歐美、日本等國均主張在水產(chǎn)養(yǎng)殖中采用微生物方法降解養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮和預(yù)防病害的發(fā)生。隨著社會的發(fā)展和對環(huán)保意識的提高，微生物必將替代傳統(tǒng)藥物成為降解養(yǎng)殖水體氨態(tài)氮和預(yù)防病害的優(yōu)良產(chǎn)品，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)朝著綠色健康方向發(fā)展提供有力的保障。

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