高波 吳曉琰 陸怡

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年病科，上海 200040）

心房利鈉肽的抗腫瘤作用及其基因工程表達(dá)

高波 吳曉琰 陸怡

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年病科，上海 200040）

自心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其擴(kuò)張血管、降壓、增加血管通透性、利鈉利尿等心血管系統(tǒng)方面的作用已得到認(rèn)可，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ANP在抗腫瘤方面具有潛在的巨大價(jià)值。

1 ANP的代謝和組成

1.1 ANP的合成和降解

早在1956年Kisch就發(fā)現(xiàn)心房具有內(nèi)分泌功能［1］。1981年 Adolfo de Bold［2］發(fā)現(xiàn)第1個(gè)利鈉肽類(lèi)激素，它是通過(guò)心房心肌細(xì)胞的分泌型顆粒旁分泌發(fā)揮作用。Potter等［3］將其稱為ANP。ANP可由心房、心室、腎臟、脂肪組織及腦細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)心房顆粒釋放ANP原［4］。合成ANP的基因被稱為NPPA基因（natriuretic peptide A），位于染色體1p36.21，它可合成含151個(gè)氨基酸的前ANP原（prepro－ANP），加工切斷其前25個(gè)氨基酸后即變成含126個(gè)氨基酸的ANP原（pro－ANP）。ANP可激活穿膜的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（guanylyl cyclase）即 利 鈉 肽 受 體－A（natriuretic peptide receptor－A，NPR－A）。NPR－A可以促進(jìn)環(huán)GMP（cyclic GMP，cGMP）的合成，從而將信息傳達(dá)到胞內(nèi)發(fā)揮作用。另一種ANP相關(guān)的受體是利鈉肽受體－C（natriuretic peptide receptor－C，NPRC），它可以通過(guò)受體介導(dǎo)的攝取和降解作用清除血液循環(huán)中的利鈉肽類(lèi)激素。

1.2 ANP的組成、結(jié)構(gòu)和生理功能

pro－ANP中包括4個(gè)肽類(lèi)激素，以它們?cè)贏NP激素原N端的氨基酸序列進(jìn)行排序，ANP激素原N端的前30個(gè)氨基酸組成長(zhǎng)效利鈉肽（long acting natriuretic peptide，LANP），31～67共37個(gè)氨基酸組成血管擴(kuò)張肽（vessel dilator，VD），79～98共20個(gè)氨基酸組成利鉀肽（kaliuretic peptide，KP），99～126共28個(gè)氨基酸組成α－人心房利尿肽（α－h(huán)uman artrial natriuretic peptide，α－h(huán) ANP）。這4種多肽均在血液循環(huán)中存在，它們除有擴(kuò)張血管、降壓、延緩肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展、增加血管通透性、利鈉利尿等心血管系統(tǒng)作用外，在抗腫瘤方面也有著潛在的應(yīng)用價(jià)值［5］。

2 ANP與癌癥

2.1 ANP的抗癌作用及機(jī)制

研究［6］發(fā)現(xiàn)ANP來(lái)源的心房肽類(lèi)激素可以直接殺死腫瘤細(xì)胞或強(qiáng)力抑制癌細(xì)胞DNA的合成，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而對(duì)正常的人體細(xì)胞無(wú)損傷；它還可緩解抗癌藥物對(duì)腎臟、肝臟的毒性作用。這4種心臟激素可單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于多種腫瘤的治療。體外實(shí)驗(yàn)［7］顯示，α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP這4種ANP來(lái)源的心房肽類(lèi)激素在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中24 h可抑制近97%的人胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞以及肺小細(xì)胞癌和肺鱗狀細(xì)胞癌的癌細(xì)胞；且在裸鼠體內(nèi)可使人胰腺癌細(xì)胞及人乳腺癌細(xì)胞減少80%以上，使人肺小細(xì)胞癌細(xì)胞減少86%以上。

ANP來(lái)源的心房肽類(lèi)激素主要是以腫瘤細(xì)胞中的 Ras－Raf－MEK 1/2－ERK 1/2 激 酶 級(jí) 聯(lián)為靶點(diǎn)［7－8］。Ras－Raf－MEK1/2－ERK1/2 信 號(hào) 通 路 是Ras受上游信號(hào)激活后連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白激酶，使下游蛋白磷酸化而產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Raf被Ras激活后，激活下游的絲裂原活 化 細(xì) 胞 外 調(diào) 節(jié) 激 酶 1/2 （mitogen－activated protein/extracellular signed－regulated kinase 1/2，MEK1/2），MEK1/2進(jìn)而激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal－regulated kinase1/2，ERK1/2），活化的ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化特定基因上的特定位點(diǎn)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄。該信號(hào)通路在細(xì)胞增殖，細(xì)胞調(diào)亡，細(xì)胞分化、癌變等方面起著重要的作用，在多種腫瘤組織與細(xì)胞中均可檢測(cè)到Ras－Raf－MEK－ERK通路的異常過(guò)度激活。α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP可抑制達(dá)95%的基礎(chǔ)Ras的活性、98%的 MEK 1/2的磷酸化以及97%的基礎(chǔ)ERK1/2的激活。ANP來(lái)源的心房肽類(lèi)激素的抗癌機(jī)制均是通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞核抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成［7］。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)［9］證明α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP分別抑制有絲分裂原表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）激活Ras的作用，濃度為1 μmo L的α－h(huán) ANP、VD、LANP及 KP抑制5 ng/m L的EGF激活Ras的程度分別是33%、73%、79%及45%。對(duì)EGF的特異作用可以用5μmo L的心臟激素抗體阻斷，其程度分別是100%、95%、93%及100%。這項(xiàng)研究表明ANP來(lái)源的心房肽類(lèi)激素可以抑制有絲分裂原，如EGF激活Ras的活性及非刺激的基礎(chǔ)的Ras活性。

2.2 ANP治療腫瘤的研究

目前研究ANP相關(guān)的肽類(lèi)激素治療腫瘤有效的研究綜述如下。

小細(xì)胞肺癌（體外實(shí)驗(yàn)）［10］:濃度為1μmoL的4種肽類(lèi)激素（VD、LANP、KP和α－h(huán) ANP）及cGMP 24 h內(nèi)可降低依次為63%、21%、30%、39%及31%的體外培養(yǎng)的小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞數(shù)，且在細(xì)胞數(shù)量減少后的3 d內(nèi)沒(méi)有細(xì)胞增生；在劑量曲線上，VD為100 μmoL時(shí)，24 h內(nèi)減少92%肺腺癌細(xì)胞。

乳腺癌（激素小鼠及裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)）［11］:4種心房肽類(lèi)激素混合，可殺死54%的小鼠人HTB－132乳腺癌細(xì)胞及60%的CRL－2327乳腺癌細(xì)胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在未進(jìn)行外科切除手術(shù)情況下使50%的雌性小鼠的HTB－132人乳腺癌消失且不再?gòu)?fù)發(fā)。

前列腺癌 （體外實(shí)驗(yàn)））［12－13］:在體外實(shí)驗(yàn)中，ANP、LANP在濃度為0.01～1μmo L時(shí)抑制Ras磷酸化，抑制Ras－GTP激活，通過(guò)cGMP途徑發(fā)揮抗人前列腺癌的作用。在濃度為0.01～10μmo L時(shí)，兩者抑制MEK 1/2激酶磷酸化的程度分別是97%、88%，其抑制作用在2 h達(dá)高峰，4 h停止，這種抑制作用可被cGMP抗體阻斷，cGMP本身抑制MEK 1/2激酶的程度磷酸化的程度可達(dá)93%。

黑 色 素 瘤 （體 外 實(shí) 驗(yàn)））［14］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP這4種心房肽類(lèi)激素濃度為1μmo L時(shí)可在24 h內(nèi)使體外培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞減少71%，每一種激素可使DNA合成減少達(dá)73%，通過(guò)cGMP途徑發(fā)揮抗癌作用。

結(jié)腸腺癌（體外實(shí)驗(yàn)）［15］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP在1 mmoL濃度時(shí)24 h使體外培養(yǎng)的結(jié)腸腺癌細(xì)胞減少89%～97%，使其DNA合成減少65%～83%（P＜0.001），通過(guò)cGMP途徑發(fā)揮作用。

肺鱗 狀 細(xì) 胞 癌 （體 外 實(shí) 驗(yàn)）［16］:α－h(huán) ANP、VD、LANP、KP及cGMP抑制體外培養(yǎng)的人癌細(xì)胞的程度分別為21%、51%、22%、25%及30%。VD抑制細(xì)胞DNA合成達(dá)85%，這種抗癌作用由cGMP介導(dǎo)。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（體外實(shí)驗(yàn)）［17］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP可消除近75%的體外培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，通過(guò)cGMP途徑使DNA合成減少近87%。

血 管 肉 瘤 （體 外 實(shí) 驗(yàn) ）［18］:α－h(huán) ANP、VD、LANP、KP及cGMP 24 h可使體外培養(yǎng)的血管肉瘤細(xì)胞分別減少36%、61%、30%、29%及32%，且可抑制68%～85%DNA合成。

甲狀腺髓樣癌（體外實(shí)驗(yàn)）［19］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP 24 h可使體外培養(yǎng)的甲狀腺髓樣癌細(xì)胞分別減少71%、81%、66%及68%，在癌細(xì)胞數(shù)量減少的3 d內(nèi)未出現(xiàn)新的增生，心房肽類(lèi)激素可以使DNA合成減少65%～84%。

胰腺癌（體外實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）:體外實(shí)驗(yàn)中［20］，初治無(wú)效的胰腺癌細(xì)胞對(duì)以0.1μmo L混合的4種心房肽類(lèi)激素敏感，而正常肺、腎、前列腺及內(nèi)皮細(xì)胞則不受損傷，其作用機(jī)制是抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。體內(nèi)裸鼠試驗(yàn)［21］發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，通過(guò)血管每周兩次給α－h(huán) ANP、VD（濃度100μmo L），28 d后使人胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度分別減少68%和92%［21］。在人胰腺癌的裸鼠模型中連續(xù)28 d按體質(zhì)量皮下注射3 nmol/（min·kg）α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP，可減少80%、33%、20%及14% 的胰腺癌細(xì)胞；治療后試驗(yàn)組動(dòng)物盡管沒(méi)有痊愈，但與對(duì)照組相比較，腫瘤體積減少10%。與原發(fā)性胰腺癌相比，轉(zhuǎn)移的胰腺癌動(dòng)物NPR－A受體減少33%～55%［22］，其抗腫瘤機(jī)制是抑制裸鼠胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)DNA的合成。另一項(xiàng)免疫組化研究［8］發(fā)現(xiàn)，ANP來(lái)源的心房肽類(lèi)激素在胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核聚集，這與其在惡性腫瘤細(xì)胞中降低DNA合成的抗腫瘤作用一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中這項(xiàng)作用受到局限。此項(xiàng)研究將這些抑制生長(zhǎng)的激素定位在細(xì)胞核中，它們?cè)诤藘?nèi)抑制DNA的合成，且很可能與促進(jìn)生長(zhǎng)的激素相互干擾，這就是其在體內(nèi)、外抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的病因?qū)W［8］。

3 ANP的合成

3.1 化學(xué)合成

ANP來(lái)源的心房肽類(lèi)激素可作為一種多肽類(lèi)藥物在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮良好作用。然而目前僅美國(guó)南佛羅里達(dá)大學(xué)心臟激素中心開(kāi)展了大量關(guān)于α－h(huán)ANP、VD、LANP及KP這4種心房肽類(lèi)激素的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。其原因主要是多肽合成不僅復(fù)雜而且十分昂貴，在實(shí)驗(yàn)室研究中尚不能大規(guī)模推廣。

目前多肽大規(guī)模工業(yè)化制備絕大部分都靠化學(xué)合成，在多肽合成儀中采用固相、液相或液固并用的化學(xué)方法合成。多肽化學(xué)合成的每一步都要去掉其副產(chǎn)物。氨基酸序列長(zhǎng)度越長(zhǎng)，化學(xué)合成將越繁雜，副產(chǎn)物也將越多，繼而成本也將越高。另外，多肽生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)溶劑廢液（生產(chǎn)1 kg多肽藥物約產(chǎn)生1000 L有機(jī)廢液），對(duì)環(huán)境也會(huì)產(chǎn)生極大的污染。

3.2 ANP基因工程

基因工程生產(chǎn)心房肽類(lèi)藥物應(yīng)該是一種產(chǎn)量大且相對(duì)廉價(jià)的方法，但尚在起步階段。多肽藥物基因工程合成困難的主要原因是多肽分子量較蛋白質(zhì)小，在細(xì)胞中表達(dá)后不穩(wěn)定，容易被降解。為了增加其穩(wěn)定性，可將多肽基因與載體蛋白質(zhì)基因結(jié)合，以融合蛋白的形式在原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)中表達(dá)，最后再切斷融合蛋白以獲得目的多肽。由于多肽在融合蛋白中所占比例?。?/10），因此產(chǎn)量較低。為提高獲得率，可考慮采用串聯(lián)多肽基因的方法，但其問(wèn)題是融合蛋白的切斷無(wú)論是酶切或化學(xué)切斷都很困難。也可采用真核系統(tǒng)分泌型質(zhì)粒表達(dá)多肽的方法，對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，高密度發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)量高，但從大量培養(yǎng)基中回收目的多肽相當(dāng)困難。

已有研究［23］可用基因工程合成α－h(huán) ANP，但距大規(guī)模生產(chǎn)還有待時(shí)日。

4 展 望

隨著化學(xué)合成及基因工程合成ANP類(lèi)多肽的進(jìn)展，我們有望將其從實(shí)驗(yàn)室的研究轉(zhuǎn)入實(shí)際的臨床試驗(yàn)，這不僅為臨床腫瘤提供一種新的治療手段，而且這類(lèi)多肽特定的生物學(xué)活性將使其給治療過(guò)程中所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前的各種治療手段。

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Anticancer Effects of Atrial Natriuretic Peptide and Recombinant Expression of the Peptide

GAO Bo WU

Xiaoyan LU Yi Department of Geriatrics，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China

R730.5

A

上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào):10431904000）

陸怡，E－mail:luyi＿2006＠efesco.com