許必芳 袁曉輝 朱天明 曾秀燕 熊大經(jīng)

一氧化氮(NO)在體內(nèi)是一種含自由基的氣體,易擴(kuò)散、不穩(wěn)定、半衰期極短,僅為數(shù)秒;而在大氣中則是有害的化學(xué)物質(zhì),但近年來許多研究表明極少量可調(diào)控的NO卻充當(dāng)生理和病理調(diào)節(jié)介質(zhì),是一種新型的細(xì)胞內(nèi)信使分子和效應(yīng)分子,廣泛參與機(jī)體循環(huán),呼吸,消化和神經(jīng)等各個(gè)系統(tǒng)的生理和病理調(diào)節(jié),在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1]。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物SD大鼠90只,一級(jí)動(dòng)物,體重150～200g,青年,雌雄各半,華西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):川實(shí)動(dòng)管第70號(hào)。

1.2藥品與菌株

鼻淵舒口服液實(shí)驗(yàn)制劑:成都中醫(yī)藥大學(xué)華神集團(tuán)生產(chǎn)。青霉素V鉀片:長春市新安制藥廠生產(chǎn),批號(hào):133589。稀化粘素(吉諾通膠囊):德國保時(shí)佳大藥廠生產(chǎn),進(jìn)口注冊(cè)證號(hào):X980578。鹽酸氯安酮注射液:上海第一制藥廠生產(chǎn),批號(hào):980701。鹽酸利多卡因注射液:北京萬輝藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)。批號(hào):京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1998)第104094號(hào)。腎上腺素:上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):01004。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC):四川省衛(wèi)生干部學(xué)院微生物教研室研究制備,批號(hào):25935。

1.3器械

骨穿針:6號(hào),天津市醫(yī)用儀器設(shè)備廠生產(chǎn)。高倍顯微鏡:OLYMPUS AX80型,日本生產(chǎn)。

1.4造模與分組

將大鼠按體重、性別隨機(jī)分為九組,每組十只。分別為空白組、模型組、假模型組、鼻淵舒口服液低劑量組、鼻淵舒口服液中劑量組、鼻淵舒口服液高劑量組、西藥1組、西藥2組、中藥+西藥組。其中空白組不做任何處理,假模型組為給大鼠雙側(cè)上頜竇分別注入0.1ml生理鹽水,其余組別為給大鼠雙側(cè)上頜竇分別注入0.1ml金黃色葡萄球菌混懸液(109CFU)。造模7天后開始給藥,給藥時(shí)間為7天。給藥方法為鼻淵舒口服液低劑量組:每日以臨床成人劑量5倍的鼻淵舒口服液(濃度為0.81925g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。鼻淵舒口服液中劑量組:每日以臨床成人劑量10倍的鼻淵舒口服液(濃度為1.63185g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。鼻淵舒口服液高劑量組:每日以臨床成人劑量20倍的鼻淵舒口服液(濃度為3.2637g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。西藥1組:每日以臨床成人劑量5倍的青霉素V鉀制成混懸液(含藥量相當(dāng)于10mg/kg.d)灌胃,分早晚二次灌服。西藥2組:每日以臨床成人劑量5倍的稀化粘素制成混懸液(含藥量相當(dāng)于10mg/kg.d)灌胃,分早晚二次灌服。中藥+西藥組:每日以臨床成人劑量5倍的鼻淵舒口服液(濃度為0.81925g/ml)2～3ml和含藥量相當(dāng)于10mg/kg.d的青霉素與稀化粘素灌胃,分早晚二次灌服。模型組,假模型組:每日以與用藥組等容的生理鹽水灌胃?？瞻捉M:正常喂養(yǎng),不灌胃。

1.5標(biāo)本采集與切片制備

用藥7天結(jié)束后,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行輪流處死,并立即取其鼻黏膜,放4℃冰箱保存,待所有組織取完后,用多組織合包方法[2]進(jìn)行組織處理,并浸入-170℃液氮內(nèi)保存,經(jīng)-15℃恒冷切片機(jī)連續(xù)切片,片厚10u,吹干后冷丙酮(4℃)固定5分鐘,作NADPHD標(biāo)準(zhǔn)脫氫酶組化染色[3]。染色強(qiáng)度采用目測(cè)半定量法觀察[4]。即細(xì)胞質(zhì)呈深藍(lán)色為強(qiáng)陽性反應(yīng),藍(lán)色為陽性反應(yīng),淺藍(lán)色為弱陽性反應(yīng),著色與背景相同為陰性反應(yīng)。

2 結(jié)果

鼻黏膜經(jīng)NADPH-脫氫酶染色后,不均等分布于漿液腺、黏液腺細(xì)胞質(zhì),粘膜上皮及少許血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)。空白組、假模型組、鼻淵舒中劑量組鼻黏膜染色為淺藍(lán)色,采用目測(cè)半定量法定為弱陽性;鼻淵舒低、高劑量組,西藥1組染色都比空白組顏色深,比模型組顏色淺,采用目測(cè)半定量法定為陽性,且其顏色依次加深;西藥2組,中藥+西藥組的染色與模型組的顏色非常接近,比空白組顏色深,采用目測(cè)半定量法定為強(qiáng)陽性。

3 討論

1980年,Furchgott等用兔胸主動(dòng)脈實(shí)驗(yàn)時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)乙酰膽鹼的舒血管反應(yīng)需依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的存在,才能作用于毒覃鹼樣受體發(fā)揮效應(yīng),并在隨后的研究中,把誘導(dǎo)血管松弛的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的介質(zhì)命名為內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子(EDRF)[5]。1986年,Furchgott和Ignarro分別提出EDRF就是一氧化氮(NO),1987年,Palmer等用化學(xué)發(fā)光法證明內(nèi)皮細(xì)胞可以產(chǎn)生NO,并證實(shí)EDRF就是NO。其作用機(jī)理是NO生成后可使鳥苷酸環(huán)化酶生成cGMP(環(huán)鳥苷酸環(huán)化酶),cGMP作為第二信使參與上述各種作用,NO作用后與血紅蛋白結(jié)合為高鐵血紅蛋白,代謝排出。

NOS廣泛分布于人體多種細(xì)胞、組織和器官。鼻黏膜的神經(jīng)支配來源于翼腭神經(jīng)節(jié)和頸上神經(jīng)節(jié)。Hanazawa等于1993年首先用尼克酰氨腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)-黃遞酶組織化學(xué)染色法測(cè)定大鼠鼻黏膜,發(fā)現(xiàn)其免疫陽性纖維圍繞血管、腺體和上皮下層周圍,翼腭神經(jīng)節(jié)的許多神經(jīng)元被標(biāo)記,三叉神經(jīng)節(jié)的少量神經(jīng)元亦被染色,頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元陰性,說明NOS免疫陽性纖維主要起源于翼腭神經(jīng)節(jié)[6]。Hanzawa等于1997年又用NADPH-黃遞酶組織化學(xué)染色法證明人鼻黏膜的陽性纖維分布在血管和黏膜下腺體周圍,翼腭神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元亦為陽性[4]。iNOS位于鼻竇炎患者的表層上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞,輕微炎癥的標(biāo)本顯示了在表層上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和鼻腔腺體上的集中染色,在炎癥程度和在表層上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腺體上的iNOS免疫反應(yīng)之間有明顯相關(guān)性。

急性鼻竇炎的病理特點(diǎn)是黏膜水腫,炎性細(xì)胞浸潤,上皮細(xì)胞增殖。它作為一個(gè)炎性組織的代表,上皮細(xì)胞應(yīng)答炎癥反應(yīng),而誘發(fā)iNOS的大量表達(dá),以及由此導(dǎo)致NO的大量釋放,引起一系列的血管反應(yīng)。給藥后,減少了大鼠鼻部的炎癥反應(yīng),減輕了鼻竇、鼻腔的缺氧狀況,從而使NOS的表達(dá)降低。在炎癥的發(fā)展過程中,自始至終都有炎癥介質(zhì)的釋放。NO是呼吸道的重要炎癥介質(zhì),上呼吸道的上皮組織是NO產(chǎn)生的源泉。針對(duì)NOS,我們推測(cè)鼻淵舒口服液治療大鼠實(shí)驗(yàn)性急性鼻竇炎的作用機(jī)理可能是:鼻淵舒口服液降低急性實(shí)驗(yàn)性鼻竇炎大鼠鼻黏膜中NOS的酶活性,抑制炎癥介質(zhì)NO的產(chǎn)生和釋放,從而減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)急性鼻竇炎的康復(fù)。

[1] 鐘慈聲.孫安陽 一氧化氮的生物醫(yī)學(xué)[M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1997.

[2] 李瓊英.多組織合包技術(shù)在毒理實(shí)驗(yàn)酶組織化學(xué)中的應(yīng)用.四川醫(yī)學(xué)會(huì)衛(wèi)生學(xué)會(huì)第11界毒理學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)會(huì)議交流資料,1985:118-119

[3] Lojda Z[J].Histochemistry,1979,59:153-159

[4] 黃登清,等.兔急性上頜竇鼻黏膜一氧化氮合酶的組織化學(xué)變化[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,36(1):52-53

[5] 汪顯陽.一氧化氮合酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2001,13(4):1-5

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